《原理图》
Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®是通过测定细胞释放到培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)活性进而测定细胞损害的试剂盒。LDH（乳酸脱氢酶）是存在于细胞质的一种酶，当细胞膜受到损伤时，LDH 会释放到培养基中。由于释放出的LDH 稳定，检测培养基中LDH 的量可以作为测定死细胞和受损细胞数量的指标。
本试剂盒可以测定受损细胞所释放出的LDH，其原理是LDH 催化乳酸生成丙酮酸和NADH，NADH 通过电子载体可将水溶性四唑盐WST®（无色）还原成甲臜产物（橙色），WST®甲臜产物的吸光度与LDH 的量呈正比，利用此原理可以测定死细胞和受损细胞的数量。
本试剂盒中试剂不会和活细胞反应，而且对细胞无损害，可以直接添加到含有细胞的培养基中检测（一步法）。也可以分离细胞后，加到培养基中检测（低损伤法，分离的细胞可以做其他实验）。本试剂盒采用稳定性高的WST®，配置后的溶液可以长时间保存，不需要现配现用，适用于高通量筛选。
《特点》
- 双重选择：有2种检测方法（一步法、低损伤法）
- 操作简单：不需要分离死细胞和活细胞，就可检测死细胞的LDH ＊一步法
- 仪器常用：采用常规酶标仪检测
- 稳定方便：Working Solution可冷藏保存6个月，不需要现配现用
- 双重验证：配合使用CCK-8可获得死细胞和活细胞的结果
《操作示意图》
加Working Solution 反应30 min 加Stop Solution 在490 nm测定吸光度
（在高对照孔中， 终止反应
在加Working Solution
前先加Lysis Buffer）
（在高对照孔中， 终止反应
在加Working Solution
前先加Lysis Buffer）
《适用范围》
1.细胞毒性检测
2.细胞保护、损伤
3.效靶细胞杀伤实验
(1)抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC，Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity)
(2)嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T，Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)
(3)T细胞受体疗法(TCR-T，T cell receptor)
(4)肿瘤浸润淋巴细胞疗法(TIL ，Tumor Infiltrating Lymphocyte)
(5)自体细胞免疫疗法]多种细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK，Cytokine-Induced Killer)
(6)NK自然杀伤细胞实验(NK，natural killer cell)
同时本公司还为广大从事以上研究的科研人员准备了部分的参考实验例(ADCC、CAR-T)，欢迎随时联系我们索要资料，谢谢！
一、预实验（细胞数的最佳化）
＊因为每种细胞的LDH量不同，为了得到最好的显色效果，推荐做预实验确定最佳细胞量。
1）用培养基洗涤细胞后，制成5×105 cells/ml的细胞悬液。
2）向96孔板中每孔加入100 ul培养基。
3）如图2所示，向96孔板中A行（高对照和低对照各3个孔）加入100 ul细胞悬液后，
用多通道移液器按1/2比例用培养基稀释成一个系列细胞梯度。
另外，准备高对照Blank和背景Blank（只有培养基）各3个孔。
4）在37℃ CO2培养箱中培养。＊培养时间设定跟实际细胞毒性实验的培养时间一致。
5）在高对照孔中加入10 ul Lysis Buffer。
6）在37℃ CO2培养箱中培养30 min。
7）在每孔中加入100 ul Working Solution。采用包裹铝箔等方法避光，在室温反应30 min。
8）在每孔中加入50 ul Stop Solution。
9）用酶标仪测定490 nm的吸光度。
*：以吸光度为X轴，细胞浓度为Y轴绘图，根据下面的要求选择最佳的细胞浓度：
-高对照和低对照的O.D.值之差>0.2;
-在线性曲线上的该细胞浓度的O.D.值<2.0。
-高对照和低对照的O.D.值之差>0.2;
-在线性曲线上的该细胞浓度的O.D.值<2.0。
图2
二、细胞毒性实验
1）吸取50 ul用培养基稀释过的细胞悬液至平底96孔板中。
＊用贴壁细胞时，接种细胞至96孔板过夜预培养，换成新的50 ul培养基后，进行操作步骤2）。
2）加入50 ul含有药物的培养基（表1）。
3）在37℃ CO2培养箱内培养合适的时间。
4）在高对照的孔中加入10 ul Lysis Buffer后，在37℃ CO2培养箱内培养30 min。
5）在每个孔中加入100 ul Working Solution后，在避光、室温的条件下培养30 min。
6）在每个孔中加入50 ul Stop Solution。
7）用酶标仪测定490 nm的吸光度。
表1
《方法2：低损伤法》
＊用于需要收集活细胞进行其它实验的LDH检测。
＊如果您不需要收集活细胞进行其它实验，请选择方法1：一步法。
一、预实验（细胞数的最佳化）
＊因为每种细胞的LDH量不同，为了得到最好的显色效果，推荐做预实验确定最佳细胞量。
1）用培养基洗涤细胞后，调制成5×105 cells/ml的细胞悬液。
2）向96孔板中每孔加入100 ul培养基。
3）如图3所示，向96孔板中A行（高对照和低对照各3个孔）加入100 ul细胞悬液后，
用多通道移液器按1/2比例用培养基稀释成一个系列细胞梯度。
另外，准备高对照Blank和背景Blank（只有培养基）各3个孔。
4）在每孔中加入100 μl 培养基。
5）在37℃ CO2 培养箱中培养。＊培养时间设定跟实际细胞毒性实验培养时间一致。
6）在高对照孔中加入20 μl Lysis Buffer。
7）在37℃ CO2 培养箱中培养30 min。
8）96孔板离心2 min(250×g)。
9）从每个孔中吸取100 μl 上清液至新的96 孔板中。＊为了避免吸出细胞，请小心吸取上清液。
10）在每孔中加入100 μl Working Solution。采用包裹铝箔等方法避光，在室温反应30 min。
11）在每孔中加入50 μl Stop Solution。
12）用酶标仪测定490 nm 的吸光度。
6）在高对照孔中加入20 μl Lysis Buffer。
7）在37℃ CO2 培养箱中培养30 min。
8）96孔板离心2 min(250×g)。
9）从每个孔中吸取100 μl 上清液至新的96 孔板中。＊为了避免吸出细胞，请小心吸取上清液。
10）在每孔中加入100 μl Working Solution。采用包裹铝箔等方法避光，在室温反应30 min。
11）在每孔中加入50 μl Stop Solution。
12）用酶标仪测定490 nm 的吸光度。
*：以吸光度为X轴，细胞浓度为Y轴绘图，根据下面的要求选择最佳的细胞浓度：
-高对照和低对照的O.D.值之差>0.2;
-在线性曲线上的该细胞浓度的O.D.值<2.0。
-高对照和低对照的O.D.值之差>0.2;
-在线性曲线上的该细胞浓度的O.D.值<2.0。
图3
二、细胞毒性实验
1）吸取100 μl 用培养基稀释过的细胞悬液至96孔板中。
＊用贴壁细胞时，接种细胞至96孔板过夜预培养，换成新的100 μl 培养基后，进行操作步骤2）。
2）加入100 μl 含有药物的培养基（表2）。
3）在37℃ CO2培养箱内培养合适的时间。
4）在高对照孔中加入20 μl Lysis Buffer 后，在37℃ CO2培养箱内培养30 min。
5）96孔板离心2 min(250×g)。
6）从每个孔中吸取上清液100 μl 至新的96孔板中。＊为了避免吸出细胞，请小心吸取上清液。
7）在每个孔中加入100 μl Working Solution 后，在避光、室温的条件下培养30 min。
8）在每个孔中加入50 μl Stop Solution。
＊用贴壁细胞时，接种细胞至96孔板过夜预培养，换成新的100 μl 培养基后，进行操作步骤2）。
2）加入100 μl 含有药物的培养基（表2）。
3）在37℃ CO2培养箱内培养合适的时间。
4）在高对照孔中加入20 μl Lysis Buffer 后，在37℃ CO2培养箱内培养30 min。
5）96孔板离心2 min(250×g)。
6）从每个孔中吸取上清液100 μl 至新的96孔板中。＊为了避免吸出细胞，请小心吸取上清液。
7）在每个孔中加入100 μl Working Solution 后，在避光、室温的条件下培养30 min。
8）在每个孔中加入50 μl Stop Solution。
9）用酶标仪测定490 nm的吸光度。
表2
结果的计算：
计算「样品孔 - 样品 Blank孔」「 高对照孔 - 高对照 Blank孔」「 低对照孔 - 背景 Blank孔」的
吸光度后，算出n=3 的平均值。细胞损伤率根据如下公式算出。
细胞损伤率(%) = [(A-C)/(B-C)] ×100
A ：样品的吸光度 （样品孔- 样品Blank孔）
B ：高对照的吸光度 （高对照孔- 高对照Blank孔）
C ：低对照的吸光度 （低对照孔- 背景Blank孔）
细胞损伤率(%) = [(A-C)/(B-C)] ×100
A ：样品的吸光度 （样品孔- 样品Blank孔）
B ：高对照的吸光度 （高对照孔- 高对照Blank孔）
C ：低对照的吸光度 （低对照孔- 背景Blank孔）
《实验例》
丝裂霉素C对HeLa细胞的毒性
药物：丝裂霉素C
细胞：HeLa细胞
培养基：MEM, 10% FBS
培养：37℃ ,5% CO2, 48 h
药物：丝裂霉素C
细胞：HeLa细胞
培养基：MEM, 10% FBS
培养：37℃ ,5% CO2, 48 h
