BD Horizon™ Fixable Viability Stain 780 （FVS780） 可用于在多色流式细胞术应用中区分活细胞和非活哺乳动物细胞。该染料与细胞表面和细胞内胺反应并共价结合。与非渗透性活细胞相比，可渗透性浆细胞膜（例如坏死细胞中存在的浆细胞膜）允许染料在细胞内扩散并与更高总浓度的胺共价结合。因此，存在于典型体外测定标记物中的坏死细胞 具有更高水平的染料，其荧光强度比活细胞的荧光强度高 10-20 倍。标记的细胞可以用甲醛固定，用于下游去污、冷冻和/或透化以及随后的细胞内染色，同时保持稳定的活力染色荧光。
推荐的实验流程
制备
将 FVS780 染料粉末和 180 μl 新鲜细胞培养级二甲基亚砜 （DMSO;例如，Sigma D2650） 加热至室温。加入 180 μl DMSO 并充分涡旋溶液。检查溶液并重复涡旋，直到染料储备液完全溶解。这是 Stock Solution。
存储
到达后，将干燥的染料干燥并避光储存在 -80°C 下直至使用。用 DMSO 复溶后，将储备液分小份储存在 -20°C 下。储存 90 天后请勿使用重组染料。用 DMSO 重构后 90 天后，请丢弃染料溶液。
细胞术要求
可以使用配备红色激光的流式细胞仪（例如，BD FACSCanto™ II、BD™ LSR II、BD LSRFortessa™ 或 BD Accuri™ C6）。这种染料可以从通常用于 APC-Cy™7 的滤光片（例如，780/60）中读出。使用感兴趣的细胞样品最好实现荧光补偿。在设计多色染色组合时，请注意荧光溢出到 BD Horizon™ BUV737、BD Horizon™ BV786 和 PE-Cy™7（当读取黄绿色激光时）通道。应优化面板以考虑这种溢出效应。为了减少荧光溢出，我们建议滴定 FVS780 并使用尽可能低的染料浓度，以提供足够分辨率的目标活细胞和死细胞群。
程序
细胞的 Fixable Viability Stain 780 标记
1. 使用不含叠氮化钠的缓冲液制备用于流式细胞术染色的细胞。
2. 用不含叠氮化钠和蛋白质的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （1X DPBS） 洗涤细胞一次。
3. 在不含叠氮化钠和蛋白质的 1X DPBS 中以 1-10x10^6 个细胞/ml 的浓度重悬细胞。
4. 每1 ml细胞悬液（1：1000）中加入1 μl BD Horizon Fixable™ Viability Stain 780储备液，并立即涡旋。
a. 注意：我们建议滴定染料以获得最佳性能，因为不同的细胞类型和不同的应用会导致染色出现很大程度的可变性。
5. 将混合物在室温下避光孵育 10-15 分钟。
a. 可选：或者，将混合物在 37°C 下孵育 5-7 分钟，或在 2-8°C 下孵育 30-60 分钟。
6. 用 2 ml BD Pharmingen™ 染色缓冲液 （FBS） 洗涤细胞两次（货号）。编号 554656） 或同等值。
7. 倒出上清液并轻轻混合以破坏细胞沉淀。
8. 在染色缓冲液 （FBS） 或等效物中重悬细胞。
9. 根据需要对细胞进行染色、固定和透化，以用于下游应用。
推荐的实验流程
制备
将 FVS780 染料粉末和 180 μl 新鲜细胞培养级二甲基亚砜 （DMSO;例如，Sigma D2650） 加热至室温。加入 180 μl DMSO 并充分涡旋溶液。检查溶液并重复涡旋，直到染料储备液完全溶解。这是 Stock Solution。
存储
到达后，将干燥的染料干燥并避光储存在 -80°C 下直至使用。用 DMSO 复溶后，将储备液分小份储存在 -20°C 下。储存 90 天后请勿使用重组染料。用 DMSO 重构后 90 天后，请丢弃染料溶液。
细胞术要求
可以使用配备红色激光的流式细胞仪（例如，BD FACSCanto™ II、BD™ LSR II、BD LSRFortessa™ 或 BD Accuri™ C6）。这种染料可以从通常用于 APC-Cy™7 的滤光片（例如，780/60）中读出。使用感兴趣的细胞样品最好实现荧光补偿。在设计多色染色组合时，请注意荧光溢出到 BD Horizon™ BUV737、BD Horizon™ BV786 和 PE-Cy™7（当读取黄绿色激光时）通道。应优化面板以考虑这种溢出效应。为了减少荧光溢出，我们建议滴定 FVS780 并使用尽可能低的染料浓度，以提供足够分辨率的目标活细胞和死细胞群。
程序
细胞的 Fixable Viability Stain 780 标记
1. 使用不含叠氮化钠的缓冲液制备用于流式细胞术染色的细胞。
2. 用不含叠氮化钠和蛋白质的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （1X DPBS） 洗涤细胞一次。
3. 在不含叠氮化钠和蛋白质的 1X DPBS 中以 1-10x10^6 个细胞/ml 的浓度重悬细胞。
4. 每1 ml细胞悬液（1：1000）中加入1 μl BD Horizon Fixable™ Viability Stain 780储备液，并立即涡旋。
a. 注意：我们建议滴定染料以获得最佳性能，因为不同的细胞类型和不同的应用会导致染色出现很大程度的可变性。
5. 将混合物在室温下避光孵育 10-15 分钟。
a. 可选：或者，将混合物在 37°C 下孵育 5-7 分钟，或在 2-8°C 下孵育 30-60 分钟。
6. 用 2 ml BD Pharmingen™ 染色缓冲液 （FBS） 洗涤细胞两次（货号）。编号 554656） 或同等值。
7. 倒出上清液并轻轻混合以破坏细胞沉淀。
8. 在染色缓冲液 （FBS） 或等效物中重悬细胞。
9. 根据需要对细胞进行染色、固定和透化，以用于下游应用。
