Fluo 3-AM是一种检测细胞内钙离子的荧光探针。Fluo 3若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与钙离子Ca2+结合后荧光会增加60至80倍，是目前最常用的一种钙离子荧光探针。激光共聚焦荧光显微镜具有氩激光器，所以Fluo 3可被广泛使用于这种显微镜上。这种荧光信号发出来的长波也便于减小对样品细胞的光损伤。Fluo 3也可用来检测紫外光照射下可裂解的螯合钙或其它形式的钙。Fluo 3-AM是Fluo 3的一种乙酰甲酯衍生物，通过培养，能够轻易进入细胞中。
Fluo 3-AM (钙离子荧光探针) 需用无水DMSO (anhydrous DMSO)配制。Fluo 3-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo 3-AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo 3，从而被滞留在细胞内。Fluo 3可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。
50 μg Fluo 3-AM的配制
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DMSO（μl） |
10 |
20 |
30 |
40 |
44 |
50 |
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浓度(mmol/l） |
4.4 |
2.2 |
1.5 |
1.1 |
1.0 |
0.9 |
操作说明(for Human T cells)*
试剂:
Pluronic F127
Hanks’ balanced salt solution (HBSS)
HEPES buffer saline (
操作:
3. 用HBSS稀释Fluo 3-AM溶液，制备4 µM的Fluo 3-AM working solution。
4. 将Fluo 3-AM working solution加入细胞，在37 ℃培养20分钟。
5. 加入5倍体积的含有1%胎牛血清的HBSS，再继续培养40分钟。
6. 用HEPES buffer saline洗涤细胞3次，然后用HEPES buffer saline使细胞重悬浮，制成1x105 cells/ml的溶液。
7. 37 ℃下培养10 分钟，然后用该细胞进行荧光钙离子检测。
8. 观察528 nm (excitation: 490-500 nm)时的荧光。
*标记的条件因细胞种类而异，在每次实验前，请先确定最佳条件。以上方法仅供参考。
染色实例：
加载了Fluo 3的新鲜分离的大鼠肝脏细胞PE刺激后出现规则胞浆钙振荡。上图为细胞明场图和不同时间点（min）的比例成像，下图为影响Fluo 3荧光强度随时间的变化。成像系统：Photon Technology International Inc.，显微镜Nikon TE2000U，CCD相机QuantEM512S,软件ERP。