TOPO-TA Blunt Simple Lightning Cloning Kit

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产品内容：

保存条件：

-20℃，存放 12 个月，不影响使用效果。

产品简介：

可在室温条件下，20分钟完成TA克隆或Blunt克隆，阳性率接近100%，并且免冰浴、免热激、免蓝白斑筛选，还可以连接长达10kb的DNA片段。

克隆步骤（≤3kb 片段）：                 简化步骤（≤10kb 片段） 免复苏，免液体 LB

1、连接：室温 5 分钟；                        1、连接: 37℃连接 5 min。

2、转化：室温 5 分钟；                        2、转化：冰浴 5 min，42℃热激 1 min，冰上 2 min。

3、复苏：180rpm、37℃振荡培养 10 分钟；涂板。 3、取全部菌液涂板，37℃倒置培养。

操作步骤：

1.         {C}PCR 产物的制备：

a.       {C}引物要求：引物不能磷酸化。

b.     {C}酶的选择：根据需要选择DNA 聚合酶，该载体兼容PCR 产物的A 末端和平末端。

c.        {C}电泳检测 PCR 产物的量和质量：

①仅有目的条带，可直接进行连接反应，无需纯化；

②如果有多条带，建议凝胶回收 DNA 片段;

③如果以质粒为模板的扩增，则必须进行凝胶回收，因为模板质粒也会长出非目的菌落。

2.         {C}连接反应：

1） 室温（20℃-37℃）建立连接体系（10ul 体系）：

不同大小插入片段的推荐用量：

加完试剂后，轻弹管底混匀（或轻轻吹打混匀），点甩离心收集所有液体在离心管底。

2) 室温（20℃-37℃）连接 5 分钟。连接产物可直接转化感受态细胞，或置于冰上备用。

3.         {C}转化、复苏、涂板：

1）100ul 感受态细胞，置于室温解冻（约 1 分钟左右），轻掸几次将细胞均匀悬浮。

2）     加入 10ul 连接液，轻轻混匀，室温（20℃-37℃）放置 5 分钟。

3）      加入 500ul 平衡至室温的 LB 或者 SOC 培养基(不含抗生素)，37℃ 180 rpm 振荡培养 10 min。

（注意：大于 3kb 的片段，振荡培养时间延长至 30-60 分钟，可以增加转化子。或者用简化步骤）

4）        {C}取 200l 菌液涂板(含氨苄青霉素 50-100ug/ml），培养过夜。（为得到较多克隆，4000 rpm 离心 1 min，吸弃掉部分上清，保留 100-150ul，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板）

注意：如果使用 5ul 体系，各成分按照比例减半，使用次数可以加倍。

4.         {C}转化子的筛选鉴定：

本制品阳性率相当高，一般情况下，可以达到所见即所得，只要是长出来的菌落正常（不是污染的杂菌，转化子数量也不算太少），基本就包含插入。因此插入片段不超过 2-3kb 的情况下可以不用鉴定直接挑 1-2 个菌去测序。

1）  菌落 PCR 检测：挑单菌落于 10ul 无菌水中，混匀，取 1ul 置于 25ul PCR 体系,用 PCR 引物或者M13 通用引物去鉴定阳性克隆。

2）用通用 M13F（-20）/M13R（-26）引物测序来确定是否含有目的克隆。

pTOPO-TA/Blunt 载体序列：