HiPure Plasmid Mini Kit
高纯度质粒小量快速提试剂盒
目录号：31013
产品内容：
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产品组成 |
保存 |
31013-50 |
31013-100 |
31013-200 |
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平衡液 |
室温 |
5 ml |
10 ml |
20 ml |
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溶液 P1 |
室温 |
15 ml |
25 ml |
50 ml |
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溶液 P2 |
室温 |
15 ml |
25 ml |
50 ml |
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溶液 P3 |
室温 |
20 ml |
35 ml |
70 ml |
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去蛋白液 PE |
室温 |
16 ml |
31.5 ml |
63 ml |
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漂洗液 WB |
室温 |
13 ml |
25 ml |
50 ml |
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洗脱缓冲液 EB |
室温 |
10 ml |
15 ml |
20 ml |
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RNase A (10 mg/ml) |
-20℃ |
150 ul |
250 ul |
500 ul |
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吸附柱和收集管 |
室温 |
50 套 |
100 套 |
200 套 |
保存条件：
在室温(15 ~ 25℃)干燥条件下，可保存 12 个月。加入 RNase A 后的溶液 P1 应置于 2 ~ 8℃保存，可稳定保存 6 个月,如果 P1 中 RNase A 失活，重新补加即可。
产品简介：
本试剂盒用于高纯度质粒 DNA 的小量制备。菌体经碱裂解、高盐、低 pH 处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心吸附柱吸附。通过清洗液的洗涤可去除杂质，在低盐、高 pH 条件下洗脱，最后得到纯度较高的质粒 DNA。所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、RT-qPCR、测序及转染等分子生物学实验。
产品特点：
1. 得率高：1.5 - 4.5ml 可提出多达 10 – 20 ug 的纯净质粒；
2. 纯度高：沉淀致密，去杂质彻底干净；
3. 高效：操作简便，快捷，节约时间。
注意事项：
1. 使用前请先检查平衡液、溶液 P2 和溶液P3 是否出现浑浊，如有混浊现象，可在 37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。
2. 细菌培养时间一般为 12 ~ 16 小时，过度培养会降低质粒质量甚至导致质粒 DNA 突变；
3. 注意溶液 P1，P2 和 P3 的用量比例，若细菌量增大，需按比例放大这些溶液的使用量；
4. 随菌体增多应延长溶液 P2 的作用时间，直至溶液成粘稠透明状，但时间过长会导致质粒DNA变性。
5. 质粒的产量跟细菌量、质粒拷贝数、质粒大小和操作规范程度密切相关，一般 1.5 ml 过夜培养菌体可收获约 10 ug 高拷贝质粒。
重要提示：
一、第一次使用前请先在去蛋白液 PE、漂洗液 WB 中加入指定量无水乙醇（见瓶身标签），充分混匀，并做好标记，以免多次加入。
二、首次使用时请先将 RNase A 全部加到溶液 P1 中，混匀，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存。
操作步骤：
1. 柱平衡：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入 100 ul 的平衡液，12,000 rpm 离心 1 min，弃收集管中滤液，将吸附柱重新放回收集管中。
2.取 1~ 5 ml 过夜培养的菌液，室温 12,000 rpm 离心 30 sec，尽量倒干上清，收集菌体。
（注意：根据菌液的浓度决定取液量，浓度高时取 1.5 ml 菌液离心即可，浓度低时可多收集一次）
3. 加入 250 ul 溶液P1，重悬菌体沉淀，涡旋震荡至彻底悬浮。
（注意：如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低）
4. 加入 250 ul 溶液P2，温和地上下翻转 6-8 次，使菌体充分裂解，室温放置 4 min。
（注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组 DNA 片段的污染，所用时间不要超过 5 min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加溶液 P2 的用量，在后续的操作中溶液 P3 的用量也要相应增加）
5.加入 350 ul 溶液 P3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀，
然后室温 12,000 rpm 离心 10 min。
（注意：加入溶液 P3 后应立即混合，避免产生 SDS 的局部沉淀）
6. 将上清液转移到吸附柱中，室温 12,000 rpm 离心 1 min，质粒被吸附在膜上，弃滤液。
7.可选步骤：向吸附柱中加入 500 ul 去蛋白液 PE，室温 12,000 rpm 离心 1 min，弃滤液。
（注意：去蛋白液 PE 为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防酒精挥发）
（注意：如果宿主菌是 endA-，如 DH5α或 TOP10，此步骤可省略。如果宿主菌是 endA+，如 TG1、BL21、 HB101、JM101 等，此步骤不可省略，因这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒。如果提取低拷贝质粒也推荐采用此步骤）
8. 加入 600 ul 漂洗液 WB，室温 12,000 rpm 离心 30 sec，弃滤液。
（注意：漂洗液 WB 为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防酒精挥发）
9. 重复步骤 8 一次。
10. 室温 12,000 rpm 离心 2 min，甩干残留液体。
（注意：此步不能省略，否则残留乙醇会影响质粒的后续使用）
11. 将吸附柱置于一个新的 1.5 ml 离心管（自备）中，加入 50 ~ 100 ul 的洗脱缓冲液 EB，室温放置 2 min，12,000 rpm 离心 1 min，离心管底溶液即质粒 DNA。
（注意：事先在 65~70℃水浴中预热洗脱缓冲液 EB，可增加洗脱效率；如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，再次离心 1 min 收集；如需使用去离子水洗脱，可用 NaOH 调整其 pH 值在 7.0 - 8.5 之间。）
低拷贝或大质粒（>10 kb）提取
如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10 kb 的大质粒，应加大菌体使用量，使用 5 ~ 10 ml 过夜培养物，同时按照比例增加溶液 P2、P2、P3 的用量，脱缓冲液 EB 应在 65℃水浴预热，在吸附和洗脱时可以适当延长时间，以增加提取效率，其它步骤相同。