FlashPure sgRNASynthesis Kit
高效 sgRNA 体外转录试剂盒
目录号:91615
产品内容
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Components |
91615-25 25 rxns (20 μl/rxn) |
91615-50 50 rxns (20 μl/rxn) |
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2×PCR Mix |
250 μl |
500 μl |
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Primer Mix |
50 μl |
100 μl |
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NTPs |
200 μl |
400 μl |
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10×Reaction Buffer |
50 μl |
100 μl |
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T7 Enzyme Mix |
50 μl |
100 μl |
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DNase I |
25 μl |
50 μl |
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Buffer MRC |
5 ml |
10 ml |
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Wash Solution 1 |
6 ml |
12 m |
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Wash Solution 2/3 |
5 ml |
10 ml |
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RNase-Free H2O |
5 ml |
10 ml |
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sgRNASpinColumnWithCollectionTubes |
25 套 |
50 套 |
保存条件： -20℃保存，有效期 12 个月。
产品简介
CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术是现在生物学、医学和育种研究等领域的常用手段。该技术体系仅需要Cas9蛋白和sgRNA即可实现高效的基因编辑，其中Cas9蛋白是通用组分（无需修改），sgRNA则需要根据不同靶位点来设计和转录。
高效sgRNA体外转录试剂盒采用T7 RNA聚合酶复合物高效转录spCas9sgRNA。试剂盒中的反应体系根据sgRNA特点进行优化，每个反应可在4小时内（实际操作为半天或1天之内）获得多达100~200μg的sgRNA。sgRNA可直接用Cas9蛋白体外切割，纯化后可用于细胞注射等实验。
试剂盒中配备了合成sgRNA转录模板，sgRNA转录所需的全部试剂，用户仅需要合成含有1条CRISPR靶点的引物就能完成sgRNA体外转录。
操作步骤：
1. 设计PCR正向引物，替换标红的N(20)即可：
Primer Target：5’TAATACGACTCACTATAGGN(20)GTTTTAGAGCTAGAAATA -3’
注：spCas9识别的靶点为20nt，共20个碱基序列，N(20)为靶位点不包含PAM的20个碱基序列，建议避免选择有3个（或3个以上）连续T碱基的位点。
2. 找公司合成Primer Target，稀释到 1mM 浓度备用。
3. 配制PCR反应体系：
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Components |
Volume (20μl) |
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2×PCR Mix |
10 μl |
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Primer Mix |
2 μl |
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Primer Target（1mM） |
0.4 μl |
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ddH2O |
7.6 μl |
4. 制备体外转录模板，设置反应程序如下：
5. 按下表配制sgRNA转录体系，37℃反应4 hours。（操作过程中采用无RNA酶耗材）
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Components |
Volume (20μl) |
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NTPs |
8 μl |
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PCR product（as template） |
8 μl |
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10×Reaction Buffer |
2 μl |
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T7 Enzyme Mix |
2 μl |
6. (可选步骤) 在反应体系中加入1 μL的DNase I ，37℃孵育 15 min，消化转录的DNA模板。
7. 过柱纯化：
提示：第一次使用前请先在 Wash Solution 1 瓶和 Wash Solution 2/3 瓶中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签，并做好标记。sgRNA 容易降解，全程使用无酶耗材，请小心操作、避免降解。
（1）于冰上，用 RNase-Free H2O 将 RNA 样品补足至 100 μL， 加入 200 μL Buffer MRC，轻柔混匀。
（2）加入 375 μL（1.25 倍体积）无水乙醇并混匀。
（3）将上一步所得溶液加入一套吸附柱中，13,000 rpm 离心 30 sec，弃滤液，将吸附柱重新套回收集管。
（4）加入 700 μl Wash Solution 1（请先检查是否已加入无水乙 醇），13,000 rpm 离心 30 sec，弃滤液。
（5）漂洗：加入 500 μl Wash Solution 2/3，13,000 rpm 离心 30 sec，弃滤液。
（6）二次漂洗：重复步骤（5）一次。
（7）干燥：将离心吸附柱于 13,000 rpm 离心 2 min，甩干残留的漂洗液。
（8）洗脱：将吸附柱放入一个新的 1.5 ml 离心管中，在吸附膜的中央悬空滴加 10 ~ 40 μl RNase-Free H2O，室温放置 2 min，13,000 rpm 离心 1 min，收集 sgRNA，用于后续实验。