过氧化物酶(Peroxidase，POD)试剂盒说明书

分光光度法 50 管/48 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

POD（EC 1.11.1.7）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。

测定原理：

POD 催化H2O2 氧化特定底物，在 470nm 有特征光吸收。

组成：

自备仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 ml 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1ml 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤和加样表：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 470nm，蒸馏水调零。

2、工作液的配制：临用前将试剂一、试剂二、试剂三按照 2.6（ml）：1.5（μl）：1（μl）的比例混匀；在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）预热 10min 以上；现配现用。

3、在 1ml 玻璃比色皿中加入 50μl 样本和 950μl 工作液，混匀，记录 470nm 下 1min 时吸光值A1 和 2min后的吸光值A2。计算ΔA＝A2-A1。

注意：

如果ΔA 小于 0.005，可将反应时间延长到 5min。如果ΔA 大于 0.5，可将样本用提取液稀释后测定，计算公式中乘以相应稀释倍数。

POD 活性计算：

1、血清（浆）POD 活性

单位定义：每 ml 血清（浆）在每 ml 反应体系中每分钟A470 变化 0.01 为一个酶活力单位。计算公式：

POD（U/ml）=ΔA×V 反总÷V 样÷0.01÷T =2000×ΔA

2、组织、细菌或细胞POD 活性

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白在每ml 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 为一个酶活力单位。

POD（U/mg prot）＝ΔA×V 反总÷（V 样×Cpr）÷0.01÷T =2000×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位定义：每 g 组织在每ml 反应体系中每分钟A470 变化 0.01 为一个酶活力单位。

POD（U/g 鲜重）＝ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.01÷T =2000×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位定义：每 1 万个细菌或细胞在每ml 反应体系中每分钟A470 变化 0.01 为一个酶活力单位。

POD（U/10⁴ cell）＝ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.01÷T =4×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1ml； V 样：加入样本体积，0.05ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量；500：细菌或细胞总数，500 万。