过氧化氢酶（Catalase，CAT）试剂盒（钼酸铵比色法）说明书
分光光度法 50 管/48 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：
CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的H2O2 清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。
测定原理：
过氧化氢能氧化 MoO 2-成MoO52-,MoO52-接受氢氧根的电子成键，分子间立即脱水缩合，得到稳定的黄色复合物(H2MoO4·XH2O)n 在 405nm 处有强烈吸收峰，其吸光值和过氧化氢浓度成线性关系。测定出体系剩余过氧化氢在 405nm 的吸光值即可反映 CAT 的催化活性。
组成：
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产品名称 |
BA6009-50T/48S |
Storage |
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提取液：酸性提取液 |
60ml |
4℃ |
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试剂一：液体 |
6ml |
4℃避光 |
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试剂二：液体 |
18ml |
RT |
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试剂三：液体 |
45ml |
4℃ |
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说明书 |
一份 |
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自备仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 ml 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
粗酶液提取：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1ml 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 405 nm。
2、在EP 管中加入下列试剂
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试剂名称（μl） |
测定管 |
空白管 |
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样本 |
15 |
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试剂一 |
90 |
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混匀，25℃准确反应 2 min |
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试剂二 |
300 |
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试剂三 |
795 |
795 |
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试剂二 |
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300 |
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提取液 |
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15 |
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试剂一 |
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90 |
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混匀，取 1ml 于 1ml 玻璃比色皿中立即测定A 空白和A 测定，ΔA=A 空白-A 测定。空 白管只需做一管。 |
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CAT 活性计算：
1、标准曲线：y = 0.18x + 0.0013 R2 = 1 x：体系中过氧化氢浓度变化值（μmol/ml）
y：吸光值差值ΔA
2、血清（浆）CAT 活力的计算:
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化 1μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(μmol /min/ml)= =(ΔA-0.0013)÷0.18×V 反总÷V 样÷T
=222.22×(ΔA-0.0013)
3、组织、细菌或细胞中 CAT 活力计算：
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟催化 1μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0013)÷0.18×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=222.22×(ΔA-0.0013)÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g 组织每分钟催化 1μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(μmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0013)÷0.18×V÷（W× V 样÷V 样总）÷T=222.22×(ΔA-0.0013)÷W
V 反总：反应体系总体积，1.2 ml；V 样：加入样本体积，0.015 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，2 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml。
注意事项：
1、预实验若发现酶活性过高（A 测定＜0.1），可用提取液适当稀释样品后测定，并在计算公式中乘以相应稀释倍数。
2、若 A 空白＜A 测定，一方面可能是酶活性过低，可将反应时间 2 延长到 5min,另一方面可能样本中杂质干扰严重，可将样本稀释 5 倍左右后测定，并在计算公式中代入实际反应时间和乘以相应稀释倍数。