荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535 nm和615 nm。
染色例：
PI可以用来进行活细胞、死细胞的双重染色
钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)溶液，它们分别可对活细胞和死细胞染色。Calcein -AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜。尽管Calcein -AM本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein -AM能脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光（激发：490 nm，发射：515 nm）。因此Calcein -AM仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（激发：535 nm，发射：617 nm）。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发，仅可观察到死细胞。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定PI和Calcein -AM的合适浓度。
I．试剂
Calcein-AM
PI
II．用荧光显微镜观察细胞形态
以HeLa细胞染色为例,请注意不同的细胞种类、不同浓度有不同的观察条件。根据细胞条件，摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓度的配制等最佳条件。
１．染色溶液的配制
1）用1 ml无水DMSO溶解1 mg Calcein-AM，制备成1 mmol/l 的Calcein-AM储备液，
2）用1 ml ddH2O溶解1 mg PI，制备成1.5 mmol/l的PI储备液（1 mg PI/1 ml H2O），
3）将Calcein-AM储备液和PI储备液放置于室温。
4）加10 μl Calcein-AM储备液和15μl PI储备液至5 ml PBS中配制成染色溶液。
Calcein-AM的终浓度为2 μmol／l，PI的终浓度为4μmol／l。
2．细胞染色
1）染色HeLa细胞等贴壁细胞时,先用Trypsin-EDTA等消化细胞，制备成细胞悬液。
2）将细胞悬液离心3分钟(1,000 rpm)。
3）去除上清液，加入PBS缓冲液，细胞数量调整至105 –106 个／ml。再用移液器充分混匀。
4）由于培养基中的血清等含有酯酶，Calcein-AM遇水会分解，会导致空白上升，所以需要离心数次，用PBS洗涤数次直到完全洗净。
5）将200 μl细胞悬液移至小试管中，加入100 μl染色溶液，在
6）在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。
7）在荧光显微镜下，先使用490±10 nm波长激发，观察黄绿色的活细胞，还可以同时观察到红色的死细胞，然后用545 nm波长激发，能够看到红色的死细胞。
*在荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以用培养基清洗掉细胞外的染料后再观察。
*Calcein-AM溶液和PI溶液可以混合在一起染色，也可以分开进行染色，加入的先后顺序没有影响。
3．染色试剂的最佳浓度
Calcein-AM和PI的最适浓度是根据不同的细胞种类而定，通过以下的操作，我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度。
1）通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育10分钟或通过在70%乙醇中孵育30分钟制备死细胞。
2）用0.1-10 μM 的PI溶液对死细胞染色，以便找到仅对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。
3）用0.1-10 μM 的Calcein-AM溶液对死细胞染色，以便找到不对细胞质染色的Calcein -AM浓度。接着用该浓度的Calcein -AM对活细胞染色以检验活细胞可否被染色。
III．注意事项
1） Calcein-AM的ester部位遇到湿气会分解，使用后请在
2）PI溶液在冷冻的条件下可以保存一年。PI有引致癌的可能性,请在使用时注意以下3点。
· 使用时一定要带手套、眼罩、口罩。
· 万一接触到皮肤的话，迅速使用大量水清洗。
· 处理方法
使用器具的洗涤液等废液请按照不同的处理方法来处理，或者按照如下的处理方法，分解后再丢弃。用UV照射或光照分解。用次氯酸钠氧化分解后，做中和处理。
