AAT Bioquest YZ-175 Cyanine 5.5 maleimide [equivalent to Cy5.5® maleimide] 1mg，产品简介：
产品品牌：AAT Bioquest
产品货号：YZ-175
产品名称：Cyanine 5.5 maleimide [equivalent to Cy5.5® maleimide]
产品规格：1mg
产品说明：
多种菁5.5（Cy5.5®）染料已被用于标记生物分子，用于荧光成像和其他基于荧光的生化分析。它们广泛用于标记肽、蛋白质和寡核苷酸等。Cy5.5®染料是最常见的红色荧光团之一。Cy5.5®马来酰亚胺容易与硫醇基团反应。Cy5.5®是GE Healthcare的商标。
示例协议
储备溶液的制备
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
1.花青5.5马来酰亚胺储备溶液（溶液B）
将无水DMSO加入花青5.5马来酰亚胺小瓶中，制成10mM储备溶液。通过移液或涡旋充分混合。注意：在开始偶联之前制备染料储备溶液（溶液B）。请及时使用。延长染料储备溶液的储存可能会降低染料活性。溶液B在避光和潮湿的情况下可以在冰箱中储存长达4周。避免冻融循环。
2. 蛋白质储备溶液（溶液A）
将 100 μL 反应缓冲液（例如，pH ~100.6 的 0 mM MES 缓冲液）与 900 μL 目标蛋白质溶液（例如抗体、蛋白质浓度>如果可能，为2mg/mL）混合，得到1mL 蛋白质标记储备溶液。注意：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为6.5±0.5。注意：不纯的抗体或用牛血清白蛋白（BSA）或其他蛋白质稳定的抗体不会被很好地标记。注意：如果蛋白质浓度低于2mg/mL，偶联效率会显著降低。为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为2-10mg/mL。
3. 可选
如果您的蛋白质不含游离半胱氨酸，则必须用DTT或TCEP处理蛋白质以产生硫醇基团。DTT或TCEP用于将二硫键转化为两个游离硫醇基团。如果使用DTT，则必须在将染料马来酰亚胺与蛋白质偶联之前，通过透析或凝胶过滤去除游离DTT。以下是生成游离硫醇基团的示例协议：
3. 将还原的IgG通过用“交换缓冲液”预平衡的过滤柱。从色谱柱上收集 0.25 mL 馏分。
4. 确定蛋白质浓度并将馏分与大部分IgG合并。这可以通过分光光度法或比色法完成。
5. 在此步骤之后尽快进行偶联（参见示例实验方案）。注意：IgG 溶液应为 >4 mg/mL 以获得最佳结果。如果抗体浓度低于 2 mg/mL，则应进行浓缩。在缓冲液交换柱上包括额外的10%的损失。注意：还原可以在pH为7-7.5的几乎任何缓冲液中进行，例如MES、磷酸盐或TRIS缓冲液。注意：步骤3和4可以用透析代替。
实验方案样本
该标记方案是为山羊抗小鼠IgG与花青5.5马来酰亚胺的偶联物开发的。您可能需要进一步优化您的特定蛋白质。注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比例的蛋白质偶联物会降低灵敏度。
运行偶联反应
纯化偶联
以下方案是使用Sephadex G-25色谱柱纯化的染料-蛋白质偶联物的示例。
产品品牌：AAT Bioquest
产品货号：YZ-175
产品名称：Cyanine 5.5 maleimide [equivalent to Cy5.5® maleimide]
产品规格：1mg
产品说明：
| 分子量 | 校正系数（260 nm） | 校正系数（280 nm） | 校正系数（482 nm） | 校正系数（565 nm） | 校正系数（650 nm） | 消光系数（厘米-1M-1) | 激发（纳米） | 发射（纳米） | 量子产率 |
| 1153.20 | 0.05 | 0.101 | 0.0017 | 0.047 | 0.454 | 250000 | 683 | 703 | 0.27 |
多种菁5.5（Cy5.5®）染料已被用于标记生物分子，用于荧光成像和其他基于荧光的生化分析。它们广泛用于标记肽、蛋白质和寡核苷酸等。Cy5.5®染料是最常见的红色荧光团之一。Cy5.5®马来酰亚胺容易与硫醇基团反应。Cy5.5®是GE Healthcare的商标。
示例协议
储备溶液的制备
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
1.花青5.5马来酰亚胺储备溶液（溶液B）
将无水DMSO加入花青5.5马来酰亚胺小瓶中，制成10mM储备溶液。通过移液或涡旋充分混合。注意：在开始偶联之前制备染料储备溶液（溶液B）。请及时使用。延长染料储备溶液的储存可能会降低染料活性。溶液B在避光和潮湿的情况下可以在冰箱中储存长达4周。避免冻融循环。
2. 蛋白质储备溶液（溶液A）
将 100 μL 反应缓冲液（例如，pH ~100.6 的 0 mM MES 缓冲液）与 900 μL 目标蛋白质溶液（例如抗体、蛋白质浓度>如果可能，为2mg/mL）混合，得到1mL 蛋白质标记储备溶液。注意：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为6.5±0.5。注意：不纯的抗体或用牛血清白蛋白（BSA）或其他蛋白质稳定的抗体不会被很好地标记。注意：如果蛋白质浓度低于2mg/mL，偶联效率会显著降低。为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为2-10mg/mL。
3. 可选
如果您的蛋白质不含游离半胱氨酸，则必须用DTT或TCEP处理蛋白质以产生硫醇基团。DTT或TCEP用于将二硫键转化为两个游离硫醇基团。如果使用DTT，则必须在将染料马来酰亚胺与蛋白质偶联之前，通过透析或凝胶过滤去除游离DTT。以下是生成游离硫醇基团的示例协议：
- 在蒸馏水中制备 1 M DTT（15.4 mg/100 μL）的新鲜溶液。
3. 将还原的IgG通过用“交换缓冲液”预平衡的过滤柱。从色谱柱上收集 0.25 mL 馏分。
4. 确定蛋白质浓度并将馏分与大部分IgG合并。这可以通过分光光度法或比色法完成。
5. 在此步骤之后尽快进行偶联（参见示例实验方案）。注意：IgG 溶液应为 >4 mg/mL 以获得最佳结果。如果抗体浓度低于 2 mg/mL，则应进行浓缩。在缓冲液交换柱上包括额外的10%的损失。注意：还原可以在pH为7-7.5的几乎任何缓冲液中进行，例如MES、磷酸盐或TRIS缓冲液。注意：步骤3和4可以用透析代替。
实验方案样本
该标记方案是为山羊抗小鼠IgG与花青5.5马来酰亚胺的偶联物开发的。您可能需要进一步优化您的特定蛋白质。注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比例的蛋白质偶联物会降低灵敏度。
运行偶联反应
- 使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）的摩尔比为 10：1 作为起点：将 5 μL 染料储备溶液（溶液 B，假设染料储备溶液为 10 mM）加入蛋白质溶液（95 μL 溶液 A）的小瓶中，有效摇匀。假设蛋白质浓度为0mg / mL，蛋白质的分子量为~05KD，蛋白质的浓度为~10.200mM。 注意：我们建议使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比为10：1。如果太少或太高，请分别以 5：1、15：1 和 20：1 确定最佳染料/蛋白质比例。
- 继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。
纯化偶联
以下方案是使用Sephadex G-25色谱柱纯化的染料-蛋白质偶联物的示例。
- 根据制造说明制备Sephadex G-25色谱柱。
- 将反应混合物（来自“运行共轭反应”）加载到Sephadex G-25色谱柱的顶部。
- 一旦样品刚好在顶部树脂表面下方运行，就加入PBS（pH 7.2-7.4）。
- 向所需样品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色谱柱纯化。合并含有所需染料-蛋白质偶联物的级分。注意：为了立即使用，染料-蛋白偶联物需要用染色缓冲液稀释，并等分用于多种用途。注意：对于长期储存，染料-蛋白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。