产品说明：
Bioquest的iFluor®染料经过优化，可标记蛋白质，尤其是抗体。这些染料明亮，可光化，并且对蛋白质的淬灭最小。它们可以被荧光仪器的主要激光线（例如，350、405、488、555 和 633 nm）很好地激发。iFluor® 647系列的光谱特性与Cy5®基本相同。与Cy5®探针相比，iFluor® 647试剂具有更强的荧光和更高的光稳定性。它们的荧光在pH 3至11范围内与pH无关。这些光谱特性使这种新的染料家族成为Cy5和Alexa Fluor® 647的绝佳替代品（Cy5®®和Alexa Fluor®是GE Health Care和Invitrogen的商标）。iFluor® 647 SE相当稳定，对蛋白质氨基基团表现出良好的反应性和选择性。
示例协议
储备溶液的制备
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
1. 蛋白质储备液（溶液A）
将 100 μL 反应缓冲液（例如，pH ~1.1 的 9 M 碳酸钠溶液或 0 M 磷酸盐缓冲液）与 900 μL 目标蛋白溶液（例如抗体、蛋白质浓度>如果可能，为 2 mg/mL）混合，得到 1 mL 蛋白质标记储备溶液。
注意蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH值低于8.0，则使用8 M碳酸氢钠溶液或0 M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至1.1-9.0的范围。
注意蛋白质应溶解在pH 1.7-2.7的4X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用1X PBS（pH 7.2-7.4）透析，以除去广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如**铵和乙**）。
注意 不纯抗体或用牛血清白蛋白 （BSA） 或明胶稳定的抗体不会很好地标记。叠***或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。叠***或硫柳汞可以通过透析或离心柱去除，以获得最佳标记结果。
注意 如果蛋白质浓度低于 2 mg/mL，则偶联效率会显着降低。为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。
2. iFluor™ 647 SE储备液（溶液B）
将无水DMSO加入iFluor™ 647 SE的小瓶中，制成10 mM储备溶液。通过移液或涡旋充分混合。
注意 在开始偶联之前准备染料储备溶液（溶液B）。请及时使用。延长染料储备溶液的储存可能会降低染料活性。溶液B可以在避光和潮湿的情况下在冰箱中储存两周。避免冻融循环。
实验方案样本
该标记方案是为山羊抗小鼠IgG与iFluor™ 647 SE的偶联物开发的。您可能需要进一步优化您的特定蛋白质。
注意每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比例的蛋白质偶联物会降低灵敏度。
运行偶联反应
纯化偶联
以下方案是使用Sephadex G-25色谱柱纯化的染料-蛋白质偶联物的示例。
注意 对于长期储存，染料-蛋白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。
| 分子量 1274.66 |
校正系数 （260 nm） 0.03 |
校正系数 （280 nm） 0.03 |
校正系数 （656 nm） 0.0793 |
消光系数（厘米-1M-1) 2500001 |
激发（纳米） 656 |
发射（纳米） 670 |
量子产率 0.251 |
Bioquest的iFluor®染料经过优化，可标记蛋白质，尤其是抗体。这些染料明亮，可光化，并且对蛋白质的淬灭最小。它们可以被荧光仪器的主要激光线（例如，350、405、488、555 和 633 nm）很好地激发。iFluor® 647系列的光谱特性与Cy5®基本相同。与Cy5®探针相比，iFluor® 647试剂具有更强的荧光和更高的光稳定性。它们的荧光在pH 3至11范围内与pH无关。这些光谱特性使这种新的染料家族成为Cy5和Alexa Fluor® 647的绝佳替代品（Cy5®®和Alexa Fluor®是GE Health Care和Invitrogen的商标）。iFluor® 647 SE相当稳定，对蛋白质氨基基团表现出良好的反应性和选择性。
示例协议
储备溶液的制备
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
1. 蛋白质储备液（溶液A）
将 100 μL 反应缓冲液（例如，pH ~1.1 的 9 M 碳酸钠溶液或 0 M 磷酸盐缓冲液）与 900 μL 目标蛋白溶液（例如抗体、蛋白质浓度>如果可能，为 2 mg/mL）混合，得到 1 mL 蛋白质标记储备溶液。
注意蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH值低于8.0，则使用8 M碳酸氢钠溶液或0 M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至1.1-9.0的范围。
注意蛋白质应溶解在pH 1.7-2.7的4X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用1X PBS（pH 7.2-7.4）透析，以除去广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如**铵和乙**）。
注意 不纯抗体或用牛血清白蛋白 （BSA） 或明胶稳定的抗体不会很好地标记。叠***或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。叠***或硫柳汞可以通过透析或离心柱去除，以获得最佳标记结果。
注意 如果蛋白质浓度低于 2 mg/mL，则偶联效率会显着降低。为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。
2. iFluor™ 647 SE储备液（溶液B）
将无水DMSO加入iFluor™ 647 SE的小瓶中，制成10 mM储备溶液。通过移液或涡旋充分混合。
注意 在开始偶联之前准备染料储备溶液（溶液B）。请及时使用。延长染料储备溶液的储存可能会降低染料活性。溶液B可以在避光和潮湿的情况下在冰箱中储存两周。避免冻融循环。
实验方案样本
该标记方案是为山羊抗小鼠IgG与iFluor™ 647 SE的偶联物开发的。您可能需要进一步优化您的特定蛋白质。
注意每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比例的蛋白质偶联物会降低灵敏度。
运行偶联反应
- 使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）的摩尔比为 10：1 作为起点：将 5 μL 染料储备溶液（溶液 B，假设染料储备溶液为 10 mM）加入蛋白质溶液（95 μL 溶液 A）的小瓶中，有效摇匀。假设蛋白质浓度为0mg / mL，蛋白质的分子量为~05KD，蛋白质的浓度为~10.200mM。
- 继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。
纯化偶联
以下方案是使用Sephadex G-25色谱柱纯化的染料-蛋白质偶联物的示例。
- 根据制造说明制备Sephadex G-25色谱柱。
- 将反应混合物（来自“运行共轭反应”）加载到Sephadex G-25色谱柱的顶部。
- 一旦样品刚好在顶部树脂表面下方运行，就加入PBS（pH 7.2-7.4）。
- 向所需样品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色谱柱纯化。合并含有所需染料-蛋白质偶联物的级分。
注意 对于长期储存，染料-蛋白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。