产品说明：
mFluor™染料专为多色流式细胞术应用而开发。这些染料具有较大的斯托克斯位移，并且可以被流式细胞仪的激光线（例如，405 nm、488 nm和633 nm）很好地激发。mFluor™ Violet 450染料的荧光激发和发射最大值分别为~405 nm和~450 nm。这些光谱特性使其成为太平洋蓝™标记染料的绝佳替代品。mFluor™ Violet 450马来酰亚胺稳定，与硫醇基团具有良好的反应性和选择性。mFluor™ Violet 450马来酰亚胺提供了一种方便的工具，用于标记单克隆、多克隆抗体或其他蛋白质（>10 kDa），用于使用紫色激光激发的流式细胞术应用。
示例协议
储备溶液的制备
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
1. mFluor™ Violet 450 马来酰亚胺储备溶液（溶液 B）
将无水DMSO加入mFluor™ Violet 450马来酰亚胺的小瓶中，制成10 mM储备溶液。通过移液或涡旋充分混合。
注意 在开始偶联之前准备染料储备溶液（溶液B）。请及时使用。延长染料储备溶液的储存可能会降低染料活性。溶液B在避光和潮湿的情况下可以在冰箱中储存长达4周。避免冻融循环。
2. 蛋白质储备溶液（溶液A）
将 100 μL 反应缓冲液（例如，pH ~100.6 的 0 mM MES 缓冲液）与 900 μL 目标蛋白溶液（例如抗体、蛋白浓度>如果可能，为 2 mg/mL）混合，得到 1 mL 蛋白标记储备液。
注意蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为6.5±0.5。
注意 不纯抗体或用牛血清白蛋白 （BSA） 或其他蛋白质稳定的抗体不会很好地标记。
注意 如果蛋白质浓度低于 2 mg/mL，则偶联效率会显着降低。为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。
可选：如果您的蛋白质不含游离半胱氨酸，则必须用DTT或TCEP处理蛋白质以产生硫醇基团。DTT或TCEP用于将二硫键转化为两个游离硫醇基团。如果使用DTT，则必须在将染料马来酰亚胺与蛋白质偶联之前，通过透析或凝胶过滤去除游离DTT。以下是生成游离硫醇基团的示例协议：
在蒸馏水中制备 1 M DTT（15.4 mg/100 μL）的新鲜溶液。
在 20 mM DTT 中制备 IgG 溶液：混合时每 ml IgG 溶液加入 20 μL DTT 原液。在室温下静置 30 分钟，无需额外混合（以尽量减少半胱氨酸对胱氨酸的再氧化）。
将还原的IgG通过用“交换缓冲液”预平衡的过滤柱。从色谱柱上收集 0.25 mL 馏分。
确定蛋白质浓度并将馏分与大部分IgG合并。这可以通过分光光度法或比色法完成。
在此步骤之后尽快进行偶联（参见示例实验方案）。
注意 IgG 溶液应为 >4 mg/mL 以获得最佳结果。如果抗体浓度低于 2 mg/mL，则应进行浓缩。在缓冲液交换柱上包括额外的10%的损失。
注意 还原可以在pH为7-7.5的几乎任何缓冲液中进行，例如MES、磷酸盐或TRIS缓冲液。
注意 步骤 3 和 4 可以用透析代替。
实验方案样本
该标记方案是为山羊抗小鼠IgG与mFluor™ Violet 450马来酰亚胺的偶联物开发的。您可能需要进一步优化您的特定蛋白质。
注意每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比例的蛋白质偶联物会降低灵敏度。
运行偶联反应
纯化偶联
以下方案是使用Sephadex G-25色谱柱纯化的染料-蛋白质偶联物的示例。
注意 对于长期储存，染料-蛋白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。
| 分子量 664.63 |
吸光度（纳米） 406 |
校正系数 （260 nm） 0.338 |
校正系数 （280 nm） 0.078 |
消光系数（厘米-1M-1) 350001 |
激发（纳米） 406 |
发射（纳米） 445 |
量子产率 0.811 |
mFluor™染料专为多色流式细胞术应用而开发。这些染料具有较大的斯托克斯位移，并且可以被流式细胞仪的激光线（例如，405 nm、488 nm和633 nm）很好地激发。mFluor™ Violet 450染料的荧光激发和发射最大值分别为~405 nm和~450 nm。这些光谱特性使其成为太平洋蓝™标记染料的绝佳替代品。mFluor™ Violet 450马来酰亚胺稳定，与硫醇基团具有良好的反应性和选择性。mFluor™ Violet 450马来酰亚胺提供了一种方便的工具，用于标记单克隆、多克隆抗体或其他蛋白质（>10 kDa），用于使用紫色激光激发的流式细胞术应用。
示例协议
储备溶液的制备
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
1. mFluor™ Violet 450 马来酰亚胺储备溶液（溶液 B）
将无水DMSO加入mFluor™ Violet 450马来酰亚胺的小瓶中，制成10 mM储备溶液。通过移液或涡旋充分混合。
注意 在开始偶联之前准备染料储备溶液（溶液B）。请及时使用。延长染料储备溶液的储存可能会降低染料活性。溶液B在避光和潮湿的情况下可以在冰箱中储存长达4周。避免冻融循环。
2. 蛋白质储备溶液（溶液A）
将 100 μL 反应缓冲液（例如，pH ~100.6 的 0 mM MES 缓冲液）与 900 μL 目标蛋白溶液（例如抗体、蛋白浓度>如果可能，为 2 mg/mL）混合，得到 1 mL 蛋白标记储备液。
注意蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为6.5±0.5。
注意 不纯抗体或用牛血清白蛋白 （BSA） 或其他蛋白质稳定的抗体不会很好地标记。
注意 如果蛋白质浓度低于 2 mg/mL，则偶联效率会显着降低。为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。
可选：如果您的蛋白质不含游离半胱氨酸，则必须用DTT或TCEP处理蛋白质以产生硫醇基团。DTT或TCEP用于将二硫键转化为两个游离硫醇基团。如果使用DTT，则必须在将染料马来酰亚胺与蛋白质偶联之前，通过透析或凝胶过滤去除游离DTT。以下是生成游离硫醇基团的示例协议：
在蒸馏水中制备 1 M DTT（15.4 mg/100 μL）的新鲜溶液。
在 20 mM DTT 中制备 IgG 溶液：混合时每 ml IgG 溶液加入 20 μL DTT 原液。在室温下静置 30 分钟，无需额外混合（以尽量减少半胱氨酸对胱氨酸的再氧化）。
将还原的IgG通过用“交换缓冲液”预平衡的过滤柱。从色谱柱上收集 0.25 mL 馏分。
确定蛋白质浓度并将馏分与大部分IgG合并。这可以通过分光光度法或比色法完成。
在此步骤之后尽快进行偶联（参见示例实验方案）。
注意 IgG 溶液应为 >4 mg/mL 以获得最佳结果。如果抗体浓度低于 2 mg/mL，则应进行浓缩。在缓冲液交换柱上包括额外的10%的损失。
注意 还原可以在pH为7-7.5的几乎任何缓冲液中进行，例如MES、磷酸盐或TRIS缓冲液。
注意 步骤 3 和 4 可以用透析代替。
实验方案样本
该标记方案是为山羊抗小鼠IgG与mFluor™ Violet 450马来酰亚胺的偶联物开发的。您可能需要进一步优化您的特定蛋白质。
注意每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比例的蛋白质偶联物会降低灵敏度。
运行偶联反应
- 使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）的摩尔比为 10：1 作为起点：将 5 μL 染料储备溶液（溶液 B，假设染料储备溶液为 10 mM）加入蛋白质溶液（95 μL 溶液 A）的小瓶中，有效摇匀。假设蛋白质浓度为0mg / mL，蛋白质的分子量为~05KD，蛋白质的浓度为~10.200mM。
- 继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。
纯化偶联
以下方案是使用Sephadex G-25色谱柱纯化的染料-蛋白质偶联物的示例。
- 根据制造说明制备Sephadex G-25色谱柱。
- 将反应混合物（来自“运行共轭反应”）加载到Sephadex G-25色谱柱的顶部。
- 一旦样品刚好在顶部树脂表面下方运行，就加入PBS（pH 7.2-7.4）。
- 向所需样品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色谱柱纯化。合并含有所需染料-蛋白质偶联物的级分。
注意 对于长期储存，染料-蛋白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。