产品说明：
大肠杆菌β-半乳糖苷酶是一种464 kD四聚体。β-半乳糖苷酶的每个单位由五个结构域组成，其中第三个是活性位点。它是细胞中必需的酶。这种酶的缺乏可导致半乳唾液酸病或Morquio B综合征。在大肠杆菌中，β-半乳糖苷酶由LacZ操纵子的活化产生。LacZ表达的检测已成为常规，每个细胞只需检测5个拷贝的β-半乳糖苷酶。该试剂盒使用红色荧光半乳糖苷酶底物，可以灵敏地区分 LacZ+ 和 LacZ- 细胞。非荧光亚状态在与半乳糖苷酶反应时产生强荧光产物。它既可用于检测 ELISA 型测定系统中的半乳糖苷酶偶联物，也可用于监测细胞中的 LacZ 基因表达。Amplite®荧光β-半乳糖苷酶检测试剂盒随附所有基本成分和优化的检测方案。它可与荧光酶标仪、荧光显微镜或流式细胞仪一起使用。它也可用于筛选半乳糖苷酶抑制剂或诱导剂。
组件
组分A：β-半乳糖苷 1瓶
组分B：反应缓冲液 1 瓶 （20 mL）
组件 C：停止缓冲区 1 瓶 （10 mL）
组分D：裂解缓冲液 1 瓶 （10 mL）
构成部分E：DMSO 1 瓶 （100 μL）
组分F：β-巯基乙* 1 瓶 （100 μL）
示例协议
一目了然
协议摘要
重要注意事项
使用前将所有套件组件解冻至室温。
储备溶液的制备
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
1. β-半乳糖苷酶底物储备溶液（200X）：
将50 μL DMSO（组分E）加入试卤灵β-半乳糖苷酶（组分A）小瓶中，制成200X β-半乳糖苷酶底物储备溶液。注意：25 μL β-半乳糖苷酶底物储备溶液足以用于 1 个板。避光保存。
标准溶液的制备
β-半乳糖苷酶标准品
可选（如果需要标准曲线）：用0.3%β-巯基乙*测定缓冲液制备β-半乳糖苷酶（大肠杆菌）标准品的连续稀释液。将标准曲线上每个点的 50 μL 等分试样转移到板的对照孔中。β-半乳糖苷酶的最高推荐量为 200 mU/mL （200 - 400 ng）。建议对由 1 个点组成的标准曲线进行 3：8 连续稀释。注意：调整标准曲线以适应特定的实验条件，例如细胞类型、数量、转染效率和培养板的大小。每次进行测定时，必须新鲜制备标准曲线的稀释液。
工作溶液的制备
1. 0.3 % β-巯基乙*测定缓冲液：
将 30 μL β-巯基乙*（组分 F）加入 10 mL 反应缓冲液（组分 B）中，并充分混合。注意：制备酶稀释缓冲液需要额外的缓冲液，用于生成标准曲线。
2. β-Gal工作溶液：
将25 μL β-半乳糖苷酶底物储备溶液（200X）加入5 mL 0.3%β-巯基乙醇测定缓冲液中。注意：β-Gal工作溶液足以用于一个96孔板。
3. 裂解缓冲液工作溶液：
使用前将 5 μL β-巯基乙*（组分 F）加入 5 mL 裂解缓冲液（组分 D）中。注意：在裂解细胞之前，始终将0.1%β-巯基乙*加入裂解缓冲液中
实验方案样本
表 1.推荐的细胞培养板裂解缓冲液工作溶液体积。
培养板类型 裂解缓冲液工作溶液（μL/孔）
96孔板 50
24孔板 250
12孔板 500
6孔板 1000
60mm板 2000
100mm板 4000
制备哺乳动物细胞的细胞提取物
对于贴壁细胞：将裂解缓冲液工作溶液添加到培养板中。有关建议的卷，请参见表 1。
对于非贴壁细胞：将细胞沉淀到离心管中，并向管中加入 50 - 2000 μL（取决于细胞沉淀的大小）裂解缓冲液工作溶液。
运行 β-半乳糖苷酶测定
| 吸光度（纳米） 570 |
消光系数（厘米-1M-1) 650001 |
激发（纳米） 571 |
发射（纳米） 584 |
量子产率 0.751 |
大肠杆菌β-半乳糖苷酶是一种464 kD四聚体。β-半乳糖苷酶的每个单位由五个结构域组成，其中第三个是活性位点。它是细胞中必需的酶。这种酶的缺乏可导致半乳唾液酸病或Morquio B综合征。在大肠杆菌中，β-半乳糖苷酶由LacZ操纵子的活化产生。LacZ表达的检测已成为常规，每个细胞只需检测5个拷贝的β-半乳糖苷酶。该试剂盒使用红色荧光半乳糖苷酶底物，可以灵敏地区分 LacZ+ 和 LacZ- 细胞。非荧光亚状态在与半乳糖苷酶反应时产生强荧光产物。它既可用于检测 ELISA 型测定系统中的半乳糖苷酶偶联物，也可用于监测细胞中的 LacZ 基因表达。Amplite®荧光β-半乳糖苷酶检测试剂盒随附所有基本成分和优化的检测方案。它可与荧光酶标仪、荧光显微镜或流式细胞仪一起使用。它也可用于筛选半乳糖苷酶抑制剂或诱导剂。
组件
组分A：β-半乳糖苷 1瓶
组分B：反应缓冲液 1 瓶 （20 mL）
组件 C：停止缓冲区 1 瓶 （10 mL）
组分D：裂解缓冲液 1 瓶 （10 mL）
构成部分E：DMSO 1 瓶 （100 μL）
组分F：β-巯基乙* 1 瓶 （100 μL）
示例协议
一目了然
协议摘要
- 用LacZ基因制备稳定或瞬时转染的细胞
- 用测试化合物孵育细胞（样品）
- 裂解细胞
- 将裂解物转移到微量滴定板上
- 添加β-Gal 工作溶液
- 根据细胞类型在室温或 37°C 下孵育至少 10 分钟
- 添加停止解决方案
- 监测Ex/Em = 540/590 nm处的荧光强度
重要注意事项
使用前将所有套件组件解冻至室温。
储备溶液的制备
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
1. β-半乳糖苷酶底物储备溶液（200X）：
将50 μL DMSO（组分E）加入试卤灵β-半乳糖苷酶（组分A）小瓶中，制成200X β-半乳糖苷酶底物储备溶液。注意：25 μL β-半乳糖苷酶底物储备溶液足以用于 1 个板。避光保存。
标准溶液的制备
β-半乳糖苷酶标准品
可选（如果需要标准曲线）：用0.3%β-巯基乙*测定缓冲液制备β-半乳糖苷酶（大肠杆菌）标准品的连续稀释液。将标准曲线上每个点的 50 μL 等分试样转移到板的对照孔中。β-半乳糖苷酶的最高推荐量为 200 mU/mL （200 - 400 ng）。建议对由 1 个点组成的标准曲线进行 3：8 连续稀释。注意：调整标准曲线以适应特定的实验条件，例如细胞类型、数量、转染效率和培养板的大小。每次进行测定时，必须新鲜制备标准曲线的稀释液。
工作溶液的制备
1. 0.3 % β-巯基乙*测定缓冲液：
将 30 μL β-巯基乙*（组分 F）加入 10 mL 反应缓冲液（组分 B）中，并充分混合。注意：制备酶稀释缓冲液需要额外的缓冲液，用于生成标准曲线。
2. β-Gal工作溶液：
将25 μL β-半乳糖苷酶底物储备溶液（200X）加入5 mL 0.3%β-巯基乙醇测定缓冲液中。注意：β-Gal工作溶液足以用于一个96孔板。
3. 裂解缓冲液工作溶液：
使用前将 5 μL β-巯基乙*（组分 F）加入 5 mL 裂解缓冲液（组分 D）中。注意：在裂解细胞之前，始终将0.1%β-巯基乙*加入裂解缓冲液中
实验方案样本
表 1.推荐的细胞培养板裂解缓冲液工作溶液体积。
培养板类型 裂解缓冲液工作溶液（μL/孔）
96孔板 50
24孔板 250
12孔板 500
6孔板 1000
60mm板 2000
100mm板 4000
制备哺乳动物细胞的细胞提取物
- 用测试化合物处理含有LacZ基因的细胞一段时间。
- 用1X PBS洗涤细胞两次。不要移开细胞。
- 用裂解缓冲液工作溶液相应地裂解细胞。
对于贴壁细胞：将裂解缓冲液工作溶液添加到培养板中。有关建议的卷，请参见表 1。
对于非贴壁细胞：将细胞沉淀到离心管中，并向管中加入 50 - 2000 μL（取决于细胞沉淀的大小）裂解缓冲液工作溶液。
- 将上一步的细胞在室温下孵育10-15分钟，并轻轻旋转板或试管数次以确保完全裂解。
- 进行β-半乳糖苷酶测定或将样品冷冻在-80°C直至使用。注意：良好的裂解也可以通过快速冻融循环获得（在-1°C至-2°C下冷冻20-80小时，在室温下解冻）。或者，将细胞裂解液离心2-3分钟以沉淀不溶性物质，然后测定上清液。
运行 β-半乳糖苷酶测定
- 如果需要，在室温下解冻裂解细胞的管或板。如果将细胞接种在96孔板中，则直接在96孔板上进行测定。
- 将 50 μL 细胞提取物加入 96 孔板的每个孔中。如果需要标准曲线，请为标准曲线（50 uL/孔）保存一些对照孔。注意：如有必要，当转染效率非常高时，将裂解液稀释在裂解缓冲液工作溶液中，或在转染效率低时减少裂解缓冲液的体积。如果在96孔板中进行转染，或者将稳定的细胞系接种到96孔板中，则直接在板上进行测定。对于内源性β-半乳糖苷酶活性控制，从未转染的细胞中加入 50 μL 细胞裂解物。对于空白对照，加入 50 μL 裂解缓冲液工作溶液。
- 向每个孔中加入50 μL β-Gal 工作溶液。根据细胞类型，将板在室温或37°C下孵育约10分钟至4小时。
- 向每个孔中加入50μL终止缓冲液（组分 C）。终止缓冲液除了终止反应外，还会导致产物的荧光强度增加。
- 使用荧光酶标仪在Ex / Em = 540 / 590nm（截止= 570nm）处测量每个孔中溶液的荧光强度。