产品说明：
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）是细胞中发现的两种重要的辅助因子。NADH是NAD +的还原形式，NAD +是NADH的氧化形式。它通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的 2' 位置以形成 NADP。NADP用于合成代谢生物反应，如脂肪酸和核酸合成，需要NADPH作为还原剂。在叶绿体中，NADP是一种氧化剂，在光合作用的初步反应中很重要。然后，光合作用产生的NADPH被用作光合作用加尔文循环中生物合成反应的还原能力。传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定是通过监测340nm处的NADH或NADPH吸收来完成的。该方法灵敏度低，干扰高，因为测定是在需要昂贵的石英微孔板的紫外范围内进行的。该 Amplite® NAD/NADH 检测试剂盒为灵敏检测 NAD 和 NADH 提供了一种方便的方法。系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NAD/NADH。无需从样品混合物中纯化NAD/NADH。酶循环反应显著提高了检测灵敏度。与试剂盒#15258相比，该试剂盒具有更高的灵敏度。
 
平台
吸光度酶标仪
吸光度  460 纳米
推荐板  清除底部
 
组件
组分A：NAD/NADH回收酶混合物     2瓶（冻干粉）
组件 B-I：NADH 探头 1 瓶 （4 mL）
组件 B-II：NADH 探针缓冲液 1 瓶 （16 mL）
组件C：NADH标准（FW：709） 1 瓶 （142 μg）
组分D：裂解缓冲液     1 瓶 （10 mL）
 
示例协议
 
一目了然
协议摘要

1. 制备 NADH 标准品或测试样品 （50 μL）
2. 加入 NAD/NADH 工作溶液 （50 μL）
3. 在室温下孵育 15 分钟至 2 小时
4. 监测 460 nm 处的吸光度

 
重要事项 在开始实验之前，在室温下解冻每种试剂盒组分之一。
 
储备溶液的制备
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
 
NADH 标准解决方案
将 200 μL PBS 缓冲液加入 NADH 标准品（组分 C）的小瓶中，制成 1 mM （1 nmol/μL） NADH 储备溶液。
 
标准溶液的制备
NADH标准
将 10 μL 1 mM NADH 储备溶液加入 990 μL PBS 缓冲液 （pH 7.4） 中，生成 10 μM （10 pmols/μL） NADH 标准溶液 （NS7）。然后取10μM NADH标准溶液并进行1：2系列稀释，以获得剩余的连续稀释的NADH标准品（NS1 - NS6）。注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。
 
工作溶液的制备

1. 将 8 mL NADH 探针缓冲液（组分 B-II）加入 NAD/NADH 回收酶混合物（组分 A）瓶中并充分混合。
2. 将 2 mL NADH 探针（组分 B-I）加入上面的瓶子中（来自步骤 1）并充分混合。

 
注意 这种NAD / NADH工作溶液足以进行200次测定。工作溶液不稳定，及时使用，避免直接暴露在光线下。
 
实验方案样本
表 1. NADH标准品和测试样品在白壁透明底部96孔微孔板中的布局。NS = NADH 标准品（NS1 - NS7，0.156 至 10 μM）;BL = 空白控件;TS = 测试样品。

提单	提单	TS	TS
NS1	NS1	...	...
NS2	NS2	...	...
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

 
表 2. 每个孔的试剂组成。注意：高浓度的NADH（例如，>100μM，最终浓度）将导致饱和信号并使校准曲线非线性。

井	卷	试剂
NS1 - NS7	50 微升	连续稀释（0.156 至 10 μM）
提单	50 微升	PBS
TS	50 微升	测试样品

 

1. 根据表96和表1中提供的布局，将NADH标准品（NS），空白对照（BL）和测试样品（TS）制备到白壁透明底部2孔微孔板中。对于 384 孔板，每孔使用 25 μL 试剂而不是 50 μL。 注意 根据需要制备细胞或组织样品。

为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞。

2. 向NADH标准品、空白对照和测试样品的每个孔中加入50 μL NAD/NADH工作溶液，使NADH/NADH测定总体积为100μL/孔。对于 384 孔板，向每个孔中加入 25 μL 工作溶液，总体积为 50 μL/孔。
3. 将反应物在室温下孵育15分钟至2小时，避光。
4. 用460nm处的吸光度读数仪监测吸光度增加。