产品说明：

1. 线粒体是细胞超氧化物的主要生产者。产生低至中等水平的超氧化物对于正确调节许多基本细胞过程至关重要，包括基因表达、信号转导和肌肉对耐力运动训练的适应。不受控制的线粒体超氧化物产生会引发细胞氧化损伤，从而导致多种疾病的发病机制，包括癌症、心血管疾病、神经退行性疾病和衰老。细胞内线粒体超氧化物的检测对于了解适当的细胞氧化还原调节及其失调对各种病理的影响非常重要。细胞计™荧光法细胞内超氧化物检测试剂盒使用我们独特的超氧化物指示剂 MitoROS™ 520 来量化活细胞中的超氧化物水平。MitoROS™ 520是细胞通透性的，可以快速和选择性地检测线粒体中的超氧化物。与超氧化物反应时产生绿色荧光。细胞计™荧光线粒体超氧化物活性检测试剂盒提供了一种灵敏的一步荧光测定，可在孵育一小时后检测活细胞中的线粒体超氧化物。该试剂盒可用于流式细胞术和荧光显微镜应用。

平台
流式细胞仪
Excitation：488 nm 激光
Emission：530/30 nm 滤光片
仪器规格：FITC频道
荧光显微镜
Excitation：FITC过滤器套件
Emission：FITC过滤器套件
推荐板：黑色墙壁/透明底部
仪器规格：FITC过滤器套件
组件
组件 A：MitoROS™ 520—1瓶
组分B：检测缓冲液—1 瓶 （20 mL）
组件C：DMSO—1 瓶 （100 μL）

1. 在生长培养基中制备细胞
2. 用测试化合物处理细胞以诱导超氧化物
3. 添加 MitoROS™ 520 工作溶液
4. 将细胞在 37°C 下孵育 1 小时
5. 使用FITC荧光组监测荧光

实验方案摘要（流式细胞术）

1. 在生长培养基中制备细胞
2. 用测试化合物处理细胞以诱导超氧化物
3. 加入 MitoROS™ 520 储备溶液，并将细胞在 37°C 下孵育 1 小时
4. 使用530/30 nm滤光片（FITC通道）的流式细胞仪监测荧光强度

重要注意事项：使用前在室温下解冻所有组件。
储备液的制备
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
1. MitoROS 520储备溶液（500X）：
将50μLDMSO（组分C）加入MitoROS™™ 520（组分A）的小瓶中并充分混合。注意：25 μL 重构的 MitoROS™ 520 储备溶液足以用于 1 个板。注意：未使用的部分可以等分并在<-20°C下储存超过一个月，如果管子密封严密并保持避光。避免反复冻融循环。
工作溶液的制备
仅适用于荧光显微镜
将 5 μL 500X DMSO 重构的 MitoROS™ 520 储备溶液加入 2 mL 检测缓冲液（组分 B）中并充分混合。注意：这种工作溶液不稳定，需要在使用前新鲜制备。
实验方案样本
对于荧光显微镜/96孔微孔板：

1. 在培养基或所需的缓冲液（如 PBS 或 HHBS）中用 10 μL 10X 测试化合物（96 孔板）或 5 μL 5X 测试化合物（384 孔板）处理细胞。对于对照孔（未处理的细胞），加入相应量的复合缓冲液。
2. 为了诱导超氧化物，将细胞在37°C下孵育所需的时间，避光。注意：我们用 264 μM 抗mei素 A （AMA） 在 7°C 下处理 RAW 5.37 巨噬细胞 2 小时以诱导超氧化物。有关详细信息，请参见图 1。
3. 将 100 μL/孔（96 孔板）或 25 μL/孔（384 孔板）的 MitoROS™ 520 工作溶液添加到细胞板中。
4. 将细胞在37°C孵育1小时，并使用带有FITC滤光片组的荧光显微镜拍摄图像。

对于流式细胞仪：

1. 根据需要处理细胞。
2. 为了诱导超氧化物，将细胞在37°C下孵育所需的时间，避光。注意：我们用50μM抗霉素A（AMA）在37°C下处理Jurkat细胞2小时以诱导超氧化物。
3. 将 1 μL/0.5 mL 的 MitoROS™ 520 储备溶液 （500X） 细胞加入细胞中。
4. 将细胞在 5% CO 中孵育₂，37°C培养箱1小时，并使用带有530/30nm滤光片（FITC通道）的流式细胞术监测荧光强度。