产品说明：
一氧化氮（NO）是一种重要的生物调节因子，参与许多生理和病理过程。NO生成改变与各种免疫，心血管，神经退行性和炎症性疾病有关。作为一种自由基，NO被迅速氧化，体内存在的NO浓度相对较低。检测和理解NO在生物系统中的作用一直具有挑战性。细胞计™荧光法细胞内一氧化氮检测试剂盒提供了一种灵敏的工具，用于监测活细胞中的细胞内NO水平。我们的试剂盒中开发并使用了硝酸™探针，作为DAF-2的绝佳替代品，用于检测和成像细胞中的游离NO。与常用的DAF-2探针相比，硝酸™探针具有更好的光稳定性和增强的细胞通透性。该特定试剂盒使用硝酸™橙，可以与NO反应产生明亮的橙色荧光产物，其光谱特性类似于Cy3®和TRITC。亚硝酸™橙可以很容易地加载到活细胞中，并且可以使用Cy3®或TRITC的滤光片组方便地监测其荧光信号。该试剂盒针对荧光成像和酶标仪应用进行了优化。
平台
荧光酶标仪
Excitation：540 纳米
Emission：590 纳米
近路：570 纳米
推荐板：黑色墙壁/透明底部
仪器规格：底部读取模式
组件
组分A：500X亚硝酸™橙 1 瓶 （50 μL）
组分B：检测缓冲液I 1 瓶 （20 mL）
组分C：检测缓冲液II     1 瓶 （20 mL）

1. 在生长培养基中制备细胞
2. 用测试化合物和硝酸™橙工作溶液在37孵育细胞oC 表示所需时间段
3. 添加检测缓冲液II
4. 在Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 nm）或使用TRITC滤光片监测荧光显微镜下监测荧光强度（底部读取模式）

重要说明：在开始实验之前，在室温下解冻所有试剂盒成分。
工作溶液的制备
将 20 μL 500X 亚硝酸橙储备溶液（组分 A）加入 10 mL 检测缓冲液 I（组分 B）中，充分混合制成硝酸™™橙工作溶液。这种硝酸™橙工作溶液在室温下至少可稳定保存 2 小时。避光。注意：20 μL 500X 亚硝™酸橙储备溶液足以用于一个板。
实验方案样本

1. 为了刺激内源性NO，在细胞培养基或所需的缓冲液（如PBS或HHBS）中用10 μL 10X测试化合物（96孔板）或5 μL 5X测试化合物（384孔板）处理细胞。对于对照孔（未处理的细胞），加入相应量的培养基或复合缓冲液。注意：在添加化合物之前不需要清洗细胞。但是，如果测试化合物对血清敏感，则可以在添加化合物之前吸走生长培养基和血清因子。抽吸后加入 90 μL/孔（96 孔板）和 20 μL/孔（384 孔板）的 1X Hank 盐溶液和 20 mM Hepes 缓冲液 （HHBS） 或您选择的缓冲液。或者，细胞可以在无血清培养基中生长。
2. 在细胞板中加入 100 μL/孔（96 孔板）或 25 μL/孔（384 孔板）的亚硝酸™橙工作溶液。将细胞与测试化合物和硝酸™橙工作溶液在 37°C 下共孵育所需的时间，避光。注意：请勿去除测试化合物。对于NONOate阳性对照处理：将细胞与硝酸™橙工作溶液在37°C下孵育30分钟。除去工作溶液，并将细胞进一步与1mM DEA / NONOate在37°C下孵育30分钟以产生一氧化氮。注意：我们使用 Raw 264.7 细胞在 0°C 的细胞培养基中与 5.20X 硝酸™橙、1 μg/mL 脂多糖 （LPS） 和 37 mM L-精氨酸 （L-Arg） 一起孵育 16 小时。
3. 去除每个孔中的溶液。
4. 对于100孔板，添加96μL/孔的测定缓冲液II（组分C）或对于25孔板的384μL/孔。注意：添加检测缓冲液II前不要洗涤细胞。
5. 使用酶标仪在Ex / Em = 540 / 590nm（截止= 570nm）下以底部读取模式监测荧光增加，或使用带有TRITC滤光片的荧光显微镜拍摄图像。