产品说明：
一氧化氮（NO）是一种重要的生物调节因子，参与许多生理和病理过程。NO生成改变与各种免疫，心血管，神经退行性和炎症性疾病有关。作为一种自由基，NO被迅速氧化，体内存在的NO浓度相对较低。检测和理解NO在生物系统中的作用一直具有挑战性。细胞计™荧光法细胞内一氧化氮检测试剂盒提供了一种灵敏的工具，用于监测活细胞中的细胞内NO水平。我们的试剂盒中开发并使用了硝酸™探针，作为DAF-2的 jue jia 替代品，用于检测和成像细胞中的游离NO。与常用的DAF-2探针相比，硝酸™探针具有更好的光稳定性和增强的细胞通透性。该特殊试剂盒使用硝™基红，可以与NO反应产生具有类似于德克萨斯红®光谱特性的亮红色荧光产物。Nitrixyte™ Red可以很容易地加载到活细胞中，并且可以使用Red滤光片组方便地监测其荧光信号。该试剂盒针对流式细胞术应用进行了优化。
平台
流式细胞仪
Excitation：488 nm 激光
Emission：610/20 nm 滤光片
仪器规格：德州红色频道
组件
组分A：500X氮化硅红色™     1 瓶 （100 μL）
组分B：非阳性对照    1瓶（冻干粉）
组分C：检测缓冲液‘’1‘’ ‘’瓶‘’ ‘’（‘’1‘’0‘’ ‘’m‘’L‘’）‘’

1. ‘’准‘’备‘’细‘’胞‘’：‘’（‘’0‘’.‘’5‘’ ‘’-‘’ ‘’1‘’ב’1‘’0‘’6‘’细‘’胞‘’/毫升）
2. 加入 1 μL：合物和硝酸™红在37ºC下孵育细胞所需的时间
3. 使用610/20 nm滤光片用流式细胞仪分析细胞

重要事项：在开始实验之前，在室温下解冻所有组分。
储备溶液的制备：
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
非酸阳性对照治疗储备溶液（50 mM）
将 200 uL ddH 2 O 加入 NONOate 阳性对照（组分 B）的小瓶中，制成 50 mM NONOacte 阳性对照治疗储备溶液。
工作溶液的制备
用测定缓冲液（组分C）稀释50 mM NONOate阳性对照处理储备溶液，制成1-2 mM NONOate阳性对照工作溶液。
实验方案样本

1. 对于每个样品，在您选择的 0.5 mL 温热培养基或缓冲液中制备细胞，密度为 5×105至 1×106细胞/毫升。注意：应单独评估每个细胞系，以确定NO诱导的最佳细胞密度。
2. 将 1 μL 500X 亚硝酸™红（组分 A）加入 0.5 mL 细胞悬液中。注意：对于贴壁细胞，用0.5mM EDTA轻轻提起细胞以保持细胞完整，并在用硝酸™红孵育之前用含血清的培养基洗涤细胞一次。
3. 将细胞与测试化合物和硝酸™红在37ºC下孵育所需的时间，以产生内源性或外源性NO。 注意：适当的孵育时间取决于所使用的单个细胞类型和测试化合物。优化每个实验的孵育时间。注意：我们使用 Raw 264.7 细胞在 20 ºC 的细胞培养基中与硝酸™红工作溶液、1 μg/mL 脂多糖 （LPS） 和 37 mM L-精an酸 （L-Arg） 一起孵育 16 小时。
4. 将用硝基™红预孵育30分钟的细胞旋转下来。用1mM DEA NOate阳性对照工作溶液重悬细胞，并在37ºC下再孵育30分钟。有关详细信息，请参见图 1。
5. 使用流式细胞仪中的610/20 nm滤光片监测荧光强度。对感兴趣的细胞进行门控，不包括碎片。