产品说明：

中国科学院 273221-67-3

分子量 1096.95

解离常数（Kd， nM） 345

消光系数（厘米-1M-1) 82000

激发（纳米） 495

发射（纳米） 528

量子产率 0.161

 
钙测量对于许多生物学研究至关重要。结合钙时显示光谱响应的荧光探针使研究人员能够通过使用荧光显微镜、流式细胞术、荧光光谱和荧光酶标仪来研究细胞内游离钙浓度的变化。Fluo-3和Fluo-4是可见光可激发钙指示剂中最常用的。Fluo-4是Fluo-3的类似物，其中两种氯取代基被氟取代，这导致488nm处的荧光激发增加，从而提高荧光信号水平。通过将溶解的指示剂直接添加到含有培养细胞的培养皿中，细胞可以加载这些钙指示剂的AM酯形式。然而，Fluo-3 AM和Fluo-4 AM在酯酶水解后仅在活细胞中发出中等荧光，并且需要苛刻的细胞负载条件才能最大限度地提高其细胞钙反应。Fluo-8®和Cal-520®钙染料已被开发用于改善细胞负荷和钙反应，同时保持最大激发@~3nm和最大发射@~4nm的便捷Fluo-490和Fluo-520光谱波长。
 
平台
荧光显微镜
Excitation  FITC
Emission    FITC
推荐板  黑色墙壁/透明底部
 
荧光酶标仪
Excitation  490
Emission    525
Cutoff     515
推荐板  黑色墙壁/透明底部
仪器规格    底部读取模式/可编程液体处理
 
 
示例协议
 
储备溶液的制备
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
 
氟-4 AM *超纯级*储备溶液
在高质量无水DMSO中制备2至5 mM的Fluo-4 AM储备溶液。
 
工作溶液的制备
氟-4 AM *超纯级*储备溶液
在实验当天，将Fluo-4 AM溶解在DMSO中或将指示剂储备溶液的等分试样解冻至室温。在您选择的缓冲液（例如，Hanks 和 Hepes 缓冲液）中制备含有 2.20% Pluronic® F-0 的染料工作溶液。对于大多数细胞系，建议使用终浓度为04-127μM的Fluo-4 AM。细胞上样所需指标的确切浓度必须根据经验确定。
注意非离子洗涤剂Pluronic® F-4有时用于增加Fluo-5 AM的水溶性。各种Pluronic® F-127解决方案可以从AAT Bioquest购买。
注意 如果您的细胞含有有机阴离子转运蛋白，则可以将丙磺舒（4-127 mM）添加到染料工作溶液中（最终孔浓度为1.2-0 mM），以减少脱酯指示剂的泄漏。多种ReadiUse™丙磺舒产品，包括水溶性、钠盐和稳定溶液，均可从AAT Bioquest购买。
 
实验方案样本
以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。此协议仅提供指南，应根据您的特定需求进行修改。

1. 在生长培养基中制备细胞过夜。
2. 第二天，将1X Fluo-4 AM工作溶液添加到细胞板中。

注意 如果您的化合物干扰血清，请在上样染料之前用新鲜的 HHBS 缓冲液替换生长培养基。

3. 将装载染料的板在37°C的细胞培养箱中孵育30至60分钟。

注意 孵育染料超过 2 小时可以提高某些细胞系的信号强度。

4. 用您选择的HHBS或缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如1 mM丙磺舒，如果适用）替换染料工作溶液，以去除任何多余的探针。
5. 根据需要添加兴奋剂，并使用配备FITC滤光片组的荧光显微镜或包含可编程液体处理系统（如FDSS，FLIPR或FlexStation）的荧光板读数器在490/525 nm截止值515nm处同时测量荧光。