产品说明：
       细胞内钙通量测定是一种广泛用于监测信号转导途径和高通量筛选G蛋白偶联受体（GPCR）和钙通道靶标的方法。随后在3年推出Fluo-1989，Fluo-4，Fluo-8和Cal-520，后来开发了具有改进的信号/背景比，并成为共聚焦显微镜，流式细胞术和高通量筛选应用中广泛使用的Ca2+指示剂。然而，Fluo-4仍然存在一些严重的问题。例如，对于Fluo-3，在所有大多数使用Fluo-4 AM的细胞内钙测定中，都需要丙磺shu 来防止细胞负载的Fluo-4泄漏出细胞。丙磺shu 与基于Fluo-4的钙测定一起使用会影响测定结果，因为丙磺shu 已被充分证明具有各种复杂的细胞效应。Calbryte™ 520，AM是一种用于测量细胞内钙的新型荧光和细胞渗透性指示剂。与其他染料AM酯一样，Calbryte™ 520 AM是无荧光和不可活化的。一旦Calbryte™ 520 AM进入细胞，它很容易被细胞内酯酶水解，在那里它被激活并对钙有反应。激活的指示剂现在是一种极性分子，不能自由扩散通过细胞膜，基本上将其捕获在细胞内。结合钙离子后，Calbryte™ 520产生具有 ji 高信号/背景比的明亮荧光信号。它具有与Fluo-4相同的激发和发射波长，因此相同的Fluo-4测定设置可以很容易地应用于基于Calbryte™ 520的钙测定。Calbryte™ 520 AM ji 大地改善了信号/背景比和细胞内保留特性，使其成为评估GPCR和钙通道靶标以及筛选活细胞中激动剂和拮抗剂的 zui ke kao 的指标。
平台
流式细胞仪
Excitation：488 nm激光
Emission：530/30nm滤光片
仪器规格：FITC频道
荧光显微镜
Excitation：FITC
Emission：FITC
推荐板：黑色墙壁/透明底部
荧光酶标仪
Excitation：490
Emission：525
Cutoff：515
推荐板 黑色墙壁/透明底部
仪器规格   底部读取模式/可编程液体处理
储备溶液的制备
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
卡尔布里特™ 520 AM 库存解决方案
在无水DMSO中制备Calbryte™ 2 AM的5至520mM储备溶液。
工作溶液的制备
卡尔布里特™ 520 AM 库存解决方案
在实验当天，将Calbryte™ 520 AM溶解在DMSO中或将指示剂储备溶液的等分试样解冻至室温。在您选择的缓冲液（例如，Hanks 和 Hepes 缓冲液）中制备含有 2.20% Pluronic® F-0 的染料工作溶液。对于大多数细胞系，建议使用终浓度为04至127μM的Calbryte™ 520 AM。细胞上样所需指标的确切浓度必须根据经验确定。
注意非离子洗涤剂Pluronic® F-4有时用于增加Calbryte™ 5 AM的水溶性。各种Pluronic® F-127解决方案可以从AAT Bioquest购买。
注意 如果您的细胞含有有机阴离子转运蛋白，则可以将丙磺shu （520-127 mM）添加到染料工作溶液中（最终孔浓度为1.2-0 mM），以减少脱酯指示剂的泄漏。多种ReadiUse™丙磺shu 产品，包括水溶性、钠盐和稳定溶液，均可从AAT Bioquest购买。
实验方案样本
以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。此协议仅提供指南，应根据您的特定需求进行修改。

1. 在生长培养基中制备细胞过夜。
2. 第二天，将1X Calbryte™ 520 AM工作溶液添加到细胞板中。

注意 如果您的化合物干扰血清，请在上样染料之前用新鲜的 HHBS 缓冲液替换生长培养基。

3. 将装载染料的板在37°C的细胞培养箱中孵育30至60分钟。

注意 孵育染料超过 2 小时可以提高某些细胞系的信号强度。

4. 用您选择的HHBS或缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如1 mM丙磺shu ，如果适用）替换染料工作溶液，以去除任何多余的探针。
5. 根据需要添加兴 fen 剂，并使用配备FITC滤光片组的荧光显微镜或包含可编程液体处理系统（如FDSS，FLIPR或FlexStation）的荧光板读数器同时测量荧光，Ex / Em = 490 / 525 nm截止值515 nm。