产品说明：
Cal-520® AM 为检测细胞内钙动员提供了一种强大的基于均质荧光的检测工具。Cal-520® AM是一种新型荧光钙敏感染料，与现有的绿色钙指示剂（如Fluo-3 AM和Fluo-4 AM）相比，具有显着改善的信噪比和细胞内保留。表达通过钙发出信号的GPCR或感兴趣的钙通道的细胞可以预加载可以穿过细胞膜的Cal-520® AM。一旦进入细胞，Cal-520™ AM的亲脂性封闭基团就会被酯酶切割，从而产生带负电荷的荧光染料留在细胞内。与钙结合后，其荧光大大增强。当细胞用激动剂刺激时，受体发出细胞内钙释放信号，这显着增加Cal-520®的荧光。Cal-100® AM波长长、灵敏度高、荧光增强>520倍的特点，是测量细胞钙的理想指标。高信噪比和更好的细胞内保留使 Cal-520® 钙测定成为评估 GPCR 和钙通道靶标以及筛选其激动剂和拮抗剂的强大工具。
平台
荧光显微镜
Excitation：TRITC
Emission：TRITC
推荐板：黑色墙壁/透明底部
荧光酶标仪
Excitation：490
Emission：525
Cutoff：515
推荐板：黑色墙壁/透明底部
仪器规格：底部读取模式/可编程液体处理
储备溶液的制备
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
Cal-520® AM Stock Solution
在高质量无水DMSO中制备2至5 mM的Cal-520® AM储备溶液。
工作溶液的制备
Cal-520® AM Working Solution
在实验当天，将Cal-520® AM溶解在DMSO中或将指示剂储备溶液的等分试样解冻至室温。在您选择的缓冲液（例如，Hanks 和 Hepes 缓冲液）中制备含有 2.20% Pluronic® F-0 的染料工作溶液。对于大多数细胞系，建议使用终浓度为04-127μM的Cal-520® AM。细胞上样所需指标的确切浓度必须根据经验确定。
注意 非离子洗涤剂Pluronic® F-4有时用于增加Cal-5® AM的水溶性。
注意 如果您的细胞含有有机阴离子转运蛋白，则可以将丙磺shu（520-127 mM）添加到染料工作溶液中（最终孔浓度为1.2-0 mM），以减少脱酯指示剂的泄漏。多种ReadiUse™丙磺shu产品，包括水溶性、钠盐和稳定溶液，均可从AAT Bioquest购买。
实验方案样本
以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。此协议仅提供指南，应根据您的特定需求进行修改。

1. 在生长培养基中制备细胞过夜。
2. 第二天，将 1X Cal-520® AM 工作溶液添加到细胞板中。

注意 如果您的化合物干扰血清，请在上样染料之前用新鲜的 HHBS 缓冲液替换生长培养基。

3. 将装载染料的板在37°C的细胞培养箱中孵育1至2小时。

注意 孵育染料超过 2 小时可以提高某些细胞系的信号强度。

4. 用您选择的HHBS或缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如1 mM丙磺shu，如果适用）替换染料工作溶液，以去除任何多余的探针。
5. 根据需要添加兴奋剂，并使用配备FITC滤光片组的荧光显微镜或包含可编程液体处理系统（如FDSS，FLIPR或FlexStation）的荧光板读数器同时测量荧光，Ex / Em = 490 / 525 nm截止值515 nm。