产品说明：
内pH在许多细胞事件中起着重要的调节作用，包括细胞生长、钙调节、酶活性、受体介导的信号转导、离子转运、内吞作用、趋化性、细胞粘附和其他细胞过程。近年来，pH敏感荧光染料已广泛用于监测细胞内pH值的变化。使用荧光pH指示剂的成像技术还允许研究人员以更高的空间分辨率和采样密度研究这些过程，而使用其他技术（如微电极）可以实现。其中，2'，7'-双-（2-羧乙基）-5-（和-6）-羧基荧光素（BCECF）是最受欢迎的pH探针，因为它可用于按比例监测细胞pH值。然而，所有商用BCECF AM都是至少三种异构体的复杂混合物，批次间的比例不同，使BCECF应用复杂化。BCFL的开发是为了克服与BCECF AM相关的这种异构体困难。作为BCECF，BCFL表现出pH依赖性的双激发，与BCECF基本相同。它的pKa为~7.0，也与BCECF相同。与BCECF一样，BCFL的双激发光谱具有454 nm的等吸点，应使BCFL成为良好的激发比pH指示剂。BCFL比率成像使细胞内pH测定基本上独立于几个可变因素，包括染料浓度，光程长度，细胞泄漏和光漂白率。BCFL，AM是单一异构体，使得pH测量比BCECF，AM更具重现性，BCECF，AM由许多不同的异构体组成。
平台
荧光显微镜
Excitation单一： FITC比率：AmCyan/FITC
Emission单一： FITC比率：AmCyan/FITC
推荐板 黑色墙壁/透明底部
荧光酶标仪
Excitation：430, 505
Emission：535
Cutoff：515
推荐板：黑色墙壁/透明底部
仪器规格：底部读取模式
储备溶液的制备
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
比率工程™ BCFL AM 库存解决方案
在高质量无水DMSO中制备10至20 mM的RatioWorks™ BCFL AM储备溶液。
工作溶液的制备
RatioWorks™ BCFL AM 工作解决方案
在实验当天，将RatioWorks™ BCFL AM溶解在DMSO中或将指示剂储备溶液的等分试样解冻至室温。在您选择的缓冲液（例如，Hanks和Hepes缓冲液）中制备5至50μM的RatioWorks™ BCFL AM工作溶液。
注意 非离子洗涤剂Pluronic® F-127可用于增加AM酯的水溶性。在染色缓冲液中，最终的Pluronic® F-127浓度应约为0.02%。各种Pluronic® F-127产品可以从AAT Bioquest购买。避免在Pluronic® F-127存在下长期储存AM酯。
注意 如果您的细胞含有有机阴离子转运蛋白，则可以将丙磺shu（1-2 mM）添加到染料工作溶液中（最终孔浓度为0.5-1 mM），以减少脱酯指示剂的泄漏。多种ReadiUse™丙磺shu产品，包括水溶性、钠盐和稳定溶液，均可从AAT Bioquest购买。
实验方案样本
以下是将RatioWorks™ BCFL AM加载到活哺乳动物细胞中的推荐方案。此协议仅提供指南，应根据您的具体需求进行修改。

1. 根据需要准备活细胞。
2. 第二天，将 100 μL/孔（96 孔板）或 25 μL/孔（384 孔板）的 RatioWorks™ BCFL AM 工作溶液加入细胞板中。

注意 如果您的化合物干扰血清，请在上样染料前用新鲜的HHBS缓冲液（100
孔板为96 μL/孔，25孔板为384 μL/孔）替换生长培养基。

3. 将装载染料的板在37°C的细胞培养箱中孵育30至60分钟。
4. 用您选择的HHBS或缓冲液替换染料工作溶液，以去除任何多余的探针。
5. 使用 HHBS 或您选择的缓冲液制备复合板。
6. 根据需要运行pH测定，并使用配备FITC滤光片组的荧光显微镜或荧光板读数器在Ex / Em = 490 / 535 nm截止值515 nm的同时测量荧光。对于比率测量，在Ex/Em时监测荧光1= 430/535 nm 截止值 515 nm 和防爆/电磁2= 505/535 nm 截止值 515 nm。

注意化合物添加量为 50 μL/孔（96 孔板）或 25 μL/孔（384 孔板）。
注意 测定应在化合物添加后 3 至 5 分钟内完成。但是，建议至少 8 分钟进行数据收集。