产品说明：

激发（纳米） 537

发射（纳米） 618

 
我们的细胞计™检测试剂盒是一套用于监测细胞活力和增殖的工具。有多种参数可用于监测细胞活力和增殖。在正常细胞中，DNA密度根据细胞是生长，分裂，休息还是执行其正常功能而变化。细胞周期的进展由各种细胞周期调节剂之间的复杂相互作用控制。这些调节因子激活转录因子，转录因子与DNA结合并打开或关闭导致细胞分裂的蛋白质的产生。这种调节级联中的任何失误都会导致异常的细胞增殖，这是许多病理状况的基础，例如肿瘤形成。活细胞研究的潜在应用是测定细胞DNA含量和细胞周期分布，以检测生长模式的变化，监测细胞凋亡以及评估肿瘤细胞行为和抑制基因机制。该特定试剂盒旨在使用核红™ CCS1（固定细胞中的细胞周期染色剂）监测细胞周期进程和增殖。染料穿过透化的膜并插入细胞DNA。核红™ CCS1的信号强度与试剂盒中提供的RNA酶降解RNA后的DNA含量成正比。可以使用流式细胞仪（FL0通道）监测给定样品中处于G1 / G2，S和G1 / M期的细胞百分比，以及细胞凋亡前处于亚G2期的细胞的百分比。
 
组件
组件A：100X核红CCS1™ 1 瓶 （250 μL）
组分B：100X 核糖核酸酶A    1 瓶 （250 μL）
组分C：检测缓冲液     1 瓶 （50 mL）
 
示例协议
 
一目了然
协议摘要
 

1. 用密度为 5 × 10 的测试化合物制备细胞⁵至 1 × 10⁶细胞/毫升
2. 用70%乙醇固定细胞
3. 将 5 μL 100X 核红™ CCS1 和 5 μL RNase A 加入 0.5 mL 细胞溶液中
4. 在室温下孵育 30 - 60 分钟
5. 使用具有FL2通道的流式细胞仪分析细胞

 
重要事项 在开始实验之前，在室温下解冻所有组分。
 
实验方案样本

1. 用测试化合物处理细胞一段时间，以诱导细胞凋亡或其他细胞周期功能。
2. 对于每个样品，在 0.5 mL PBS 中制备密度为 ⁵ × 10 的细胞5至 1 × 10⁶细胞/毫升。

对于贴壁细胞：将细胞胰蛋白酶消化，悬浮在10%FBS培养基中，离心（1000rpm，5分钟），并将沉淀重悬于PBS中。
 
对于悬浮细胞：将细胞离心（1000 rpm，5分钟），并将沉淀悬浮在PBS（1mL）中。注意：应单独评估每个细胞系，以确定诱导细胞凋亡的最佳细胞密度。
 
用70%乙*固定细胞：

1. 将 0.5 mL 细胞悬液移入 1.2 mL 无水乙醇中（终浓度约为 70%）。
2. 将细胞在冰上孵育至少 2 小时（或在 -20°C 下孵育过夜）。细胞在染色前可在-20°C下储存长达2年。注意：乙醇通常用于细胞表面抗原用单克隆抗体染色后的固定，而甲醇通常用于细胞内抗原用单克隆抗体染色后的固定。在这个过程中，整个细胞被固定和分析。由于整个细胞团仍然存在，因此通常包括使用RNase来消除任何双链RNA。尽管正在分析整个细胞，但尝试检测一些细胞内抗原与DNA结合可能会失败，因为蛋白质从透化细胞中泄漏出来（例如绿色荧光蛋白）。在这些情况下，在酒精固定之前用10%多聚甲醛在PBS中短暂的预固定（在4 - 6°C下1分钟）将有助于将蛋白质保留在细胞中。

 
用核红™ CCS1染色细胞：

1. 以 1000 rpm 沉淀细胞 5 分钟，并用冷 PBS 至少洗涤细胞一次。 
2. 将沉淀悬浮在 0.5 mL 测定缓冲液（组分 C）中。
3. 加入 5 μL 100X 核红™ CCS1（组分 A）和 5 μL 100X RNase A（组分 B）。
4. 将细胞在室温下孵育30至60分钟。注意：适当的孵育时间取决于所使用的单个细胞类型和细胞浓度。优化每个实验的孵育时间。
5. 自选：以 1000 rpm 离心细胞 5 分钟，然后将细胞重新悬浮在 0.5 mL 检测缓冲液（组分 B）或您选择的缓冲液中。

6. 使用FL2通道（Ex / Em = 490 / 620 nm）的流式细胞仪监测荧光强度。对感兴趣的细胞进行门控，不包括碎片。