产品说明：
活性氧（ROS）是氧正常代谢的天然副产物，在细胞信号传导中起重要作用。ROS的积累导致细胞结构的严重损害。氧化应激在心血管疾病，糖尿病，骨质疏松症，中风，炎症性疾病，许多神经退行性疾病和癌症中的作用已经得到很好的确立。ROS测量将有助于确定氧化应激如何调节不同的细胞内途径。细胞计™荧光法细胞内总ROS活性检测试剂盒使用我们专有的ROS Brite™ 670传感器来量化活细胞中的ROS。细胞渗透性和非荧光 ROS Brite™ 670 在与 ROS 反应时表现出强烈的荧光信号。ROS Brite™ 670传感器位于细胞质中。ROS Brite™ 670传感器的荧光信号可以通过荧光显微镜、高内涵成像、微孔板荧光或流式细胞术进行测量。细胞计™荧光法细胞内总 ROS 活性测定试剂盒提供了一种灵敏的一步荧光测定，可在孵育 1 小时内检测活细胞中的细胞内 ROS（尤其是超氧化物和羟基自由基）。该测定可以使用荧光酶标仪或带Cy96滤光片的荧光显微镜以方便的384孔或5孔微量滴定板形式进行。
组件
组件A：ROS Brite™ 670—1瓶
组分B：检测缓冲液—1 瓶 （20 mL）
组件C：DMSO—1 瓶 （100 μL）
方案A摘要（荧光酶标仪，荧光显微镜）

1. 在生长培养基中制备细胞
2. 用测试化合物处理细胞以诱导ROS
3. 添加 ROS Brite™ 670 工作溶液（100 孔板为 96 μL/孔，25 孔板为 384 μL/孔）
4. 将细胞在37°C下染色30 - 60分钟
5. 在Ex/Em= 650/675 nm（截止= 665 nm）或使用Cy5滤光片组监测荧光显微镜时的荧光增加（底部读数模式）

方案B摘要（流式细胞仪）

1. 在生长培养基中制备细胞
2. 用测试化合物处理细胞以诱导ROS
3. 将 ROS Brite™ 670 与细胞一起孵育 30 - 60 分钟
4. 使用带APC通道的流式细胞仪监测荧光强度

重要事项 在开始实验之前，在室温下解冻所有试剂盒组分。
储备液的制备
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
ROS Brite™ 670 储备液 （500X）
将 40 μL DMSO（组分 C）加入 ROS Brite™ 670（组分 A）小瓶中，充分混合制成 500X ROS Brite™ 670 储备溶液。避光。
注意 20 μL 的 500X ROS Brite™ 670 储备溶液足以用于 1 个板。对于流式细胞仪，为方便起见，500X ROS Brite™ 670储备溶液可在DMSO中通过5个文件夹稀释至100X。储存时，请密封管子。
工作溶液的制备
将 20 μL 500X ROS Brite 670 储备溶液加入 10 mL 检测缓冲液（组分 B）中，充分混合制成 ROS Brite™™ 670 工作溶液。
注意 此ROS Brite™ 670工作溶液在室温下可稳定保存至少2小时。
实验方案样本
对于协议 A：

1. 在所需的缓冲液（如PBS或HHBS）中用10 μL 10X测试化合物（96孔板）或5 μL 5X测试化合物（384孔板）处理细胞。对于对照孔（未处理的细胞），加入相应量的复合缓冲液。
2. 为了诱导ROS，在室温或5%CO中孵育细胞板2，37°C培养箱所需时间（例如：用30μM叔丁基过氧化*（TBHP）处理Hela细胞100分钟）。
3. 向细胞板中加入 100 μL/孔（96 孔板）或 25 μL/孔（384 孔板）的 ROS Brite™ 670 工作溶液。
4. 将细胞在 5% CO 中孵育2，37°C培养箱30分钟至60分钟。
5. 用荧光酶标仪（底部读取模式）在Ex / Em = 650 / 675 nm（截止= 665 nm）下监测荧光增加，或使用带有Cy5滤光片组的荧光显微镜观察细胞。

对于协议 B：

1. 制备密度为 5 × 10 的细胞⁵至 1 × 10⁶细胞/毫升。注意：应单独评估每个细胞系，以确定诱导细胞凋亡的最佳细胞密度。
2. 在所需的缓冲液（如PBS或HHBS）中用测试化合物处理细胞。对于对照孔（未处理的细胞），加入相应量的复合缓冲液。
3. 为了诱导ROS，在室温或5%CO中孵育细胞板2，37°C培养箱至少30分钟或所需时间（用30μM叔丁基过氧化*（TBHP）处理的Hela细胞为100分钟）。
4. 将 1 μL/mL 细胞的 500X ROS Brite 670 储备溶液或 5 μL/mL 细胞的 100X ROS Brite™™ 670 储备溶液添加到细胞培养基中。
5. 将细胞在 5% CO 中孵育2，37°C培养箱30至60分钟。
6. 使用具有APC通道的流式细胞仪监测荧光强度。