产品说明：
线粒体是细胞超氧化物的主要生产者。产生低至中等水平的超氧化物对于正确调节许多基本细胞过程至关重要，包括基因表达、信号转导和肌肉对耐力运动训练的适应。不受控制的线粒体超氧化物产生会引发细胞氧化损伤，从而导致多种疾病的发病机制，包括癌症、心血管疾病、神经退行性疾病和衰老。因此，细胞内线粒体超氧化物的检测对于了解适当的细胞氧化还原调节及其失调对各种病理的影响至关重要。细胞计™荧光线粒体超氧化物活性测定试剂盒使用我们独特的超氧化物指示剂来量化活细胞中的超氧化物水平。MitoROS™ 580是活细胞通透性的，可以快速，选择性地靶向线粒体中的超氧化物。当它与超氧化物反应时会产生红色荧光。细胞计™荧光法细胞内超氧化物检测试剂盒提供灵敏的一步荧光测定，可在孵育一小时后检测活细胞中的线粒体超氧化物。该试剂盒针对流式细胞术应用进行了优化。
组件
组件 A：MitoROS™ 580—1瓶
组分B：检测缓冲液—1 瓶 （10 mL）
组件C：DMSO—1 瓶 （100 μL）

1. 制备密度为 0.5 - 1 × 10 的细胞6细胞/毫升
2. 用测试化合物处理细胞以诱导超氧化物
3. 将 1 μL 500X MitoROS™ 580 加入 0.5 mL 细胞悬液中
4. 将细胞在 37°C 下染色 1 小时
5. 使用带FL2通道的流式细胞仪监测荧光强度

重要说明：在开始实验之前，请在室温下解冻所有组分。
储备液的制备
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
1. MitoROS 580储备溶液（500X）：
将100μLDMSO（组分C）加入MitoROS 580（组分A）的小瓶中，混合均匀，制成500X MitoROS™™™ 580储备溶液。避光。注意：储存时，请密封管子。
实验方案样本

1. 对于每个样品，在您选择的 0.5 mL 生长培养基或缓冲液中制备细胞，密度为 5×10⁵至 1×10⁶细胞/毫升。注意：应单独评估每个细胞系，以确定超氧化物诱导的最佳细胞密度。
2. 在检测缓冲液（组分 B）或所需缓冲液（如 PBS）中用 25 μL 20X 测试化合物处理细胞以诱导超氧化物。对于对照细胞（未处理的细胞），加入相应量的复合缓冲液。
3. 将细胞在37°C下孵育至少30分钟或所需的时间，避光。注意：用50μM抗霉素A（AMA）在37°C下处理Jurkat细胞30分钟以诱导超氧化物。化脓花青素（50μM）或H₂O₂（1 mM） 也可用于诱导超氧化物。
4. 将 1 μL 500X MitoROS™ 580 储备溶液加入 0.5 mL 细胞悬液中。
5. 在 37°C 下孵育 1 小时。注意：对于贴壁细胞，用0.5 mM EDTA轻轻提起细胞以保持细胞完整，并在用MitoROS™ 580孵育之前用含血清的培养基洗涤细胞一次。适当的孵育时间取决于所使用的单个细胞类型和测试化合物。优化每个实验的孵育时间。
6. 使用具有FL2通道的流式细胞仪（Ex / Em = 488 / 590 nm）监测荧光强度。对感兴趣的细胞进行门控，不包括碎片。