Script III RT MasterMix
( Perfect for qPCR )
目录号:71518
产品内容
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Components |
71518-50 50 rxns (20 μl/rxn) |
71518-100 100 rxns (20 μl/rxn) |
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5x RT MasterMix |
200 μl |
400 μl |
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RNase free H2O |
1.5 ml |
1.5 ml |
保存条件
-20℃保存，有效期 12 个月。
产品简介
Script III RT MasterMix为一管式逆转录预混液，含有逆转录所需的所有试剂：Script III Hˉ RTase、RNase Inhibitor、Random primers、OligodT Primer、dNTP Mixture、RT Buffer。
只需加入RNA模板和RNase-Free H2O，15分钟即可完成逆转录反应。 操作方便快捷，逆转录产物兼容染料法和探针法qPCR，用于检测高拷贝或者低拷贝基因。
注意事项
1． 避免RNase污染。
2． 为保证反转录成功，建议使用高质量的RNA样品。
3． 5x RT MasterMix含有甘油比较粘稠，容易吸附在管壁和吸头外，导致损失，使用前请点甩离心后取用。5x RT MasterMix包含的酶过量，即使每次分别按照3.8 μl使用，也不影响使用效果。
4． 20 μl逆转录反应体系建议加入不超过1μg的Total RNA。如果目的基因的表达量非常低，最多加入5 μg Total RNA，否则，RNA量过高，可能会超出后续qPCR的线性范围。
5． 本产品适用于包含Ploy (A)结构的真核生物mRNA和不包含Ploy (A)结构的原核生物RNA、真核生物rRNA和tRNA等模板，但不适用于miRNA等小RNA模板。
6． 如果模板具有复杂二级结构或高GC区域，推荐使用变性步骤，即在操作步骤之前，将模板RNA在65℃孵育5 min后迅速转移到冰上，再加RNA模板和RNase free H2O，混匀，50°C孵育15 min进行逆转录。
第一连 cDNA 合成 (以 20 μl 反应体系为例)
重要提示：操作前，请将各组分轻弹混匀，点甩离心后置冰上备用。
1． 反应体系的配制
于冰上，在PCR管中，加入以下组分：
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Components |
Volume |
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Total RNA / mRNA |
50ng ~ 1μg / 5ng ~ 100ng |
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5x RT MasterMix |
4 μl |
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RNase-free H2O |
To 20 μl |
2． 轻柔吸打混匀，42℃孵育15 min，进行逆转录反应。
3． 85°C加热5 sec，终止反应。
逆转录产物可立即用于qPCR反应，或保存于-20°C，并在半年内使用；长期存放，请分装后存于-70°C。
qPCR
建议取1~2μl cDNA产物原液作为20μl qPCR反应体系的模板。
如果基因表达量比较高，请根据实际情况适当稀释cDNA模板后使用。
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