miRNA Real-Time PCR Assay kit

miRNA 荧光定量 PCR 检测试剂盒

目录号：71419

产品内容

保存条件

-20℃保存，有效期 24 个月。

qPCR Mix 使用前，充分融解，轻柔颠倒混匀，短期使用可放在 4 ℃，避免反复冻融。

Reverse primer(10μM )每次用完置-20 ℃保存。

产品简介

miRNA Real-Time PCR Assay kit 采用 SYBR Green I 嵌合染料法的原理进行 miRNA 荧光定量检测。

其中2x Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix是专门为miRNA 定量检测而研发的新一代2x预混液，包含除引物和 DNA 样品以外的所有 qPCR 组分，可减少操作步骤，缩短加样时间，降低污染几率。其核心组分是全新的 Hotmaster Taq DNA 聚合酶，配合精心优化的 Buffer 体系，有效抑制非特异性扩增，可对宽广浓度范围的模板进行准确定量，获得稳定可靠的 qPCR 结果，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。

预混液中含有通用型ROX，适用于所有qPCR仪，使用qPCR Mix时不需要额外添加ROX来校正仪器。

注意：该试剂盒需要与增强型miRNA cDNA 第一链合成试剂盒（加尾法）配套使用。

1. 需要自备的试剂：待检测miRNA对应的qPCR上游引物（Forward primer）

2. 待检测miRNA对应的qPCR上游引物（Forward primer）

Forward Primer设计原则：

1. 遵循引物设计的最普遍原则。

2. 以成熟的miRNA 序列为基础，将U 替换成T，这是最基础和最简单的设计方法。

3. 试剂盒中提供的下游引物的Tm 值为65℃，设计上游引物的Tm 值要尽量保证在65℃左右。

4. 若按照原则2 的方式直接设计的引物其Tm 值过低，可以在引物的5’端添加几个碱基（最好为G 或C 碱基）；也可以在3’端添加1 个或几个A 碱基；或者5’端和3’端同时修饰。

5. 若按照原则2 的方式直接设计的引物其Tm 值过高，可以在引物的5’或3’端去掉几个碱基。

操作步骤：

1. 将DNA模板、引物、2x Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix、RNase-Free H2O溶解并置冰上备用。

2. 使用时请将2 x miRNA qPCR Mix上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经轻微离心后使用。

3. 冰上配制qPCR反应体系：（以20μl反应体系为例）

1） 推荐模板加样量为1-2μl / 20μl反应体系，miRNA 第一链cDNA不应超过总反应体系的10%，对于特殊的检测体系中，高含量的cDNA 模板易导致非特异性扩增，根据所检测miRNA 的丰度适当的稀释cDNA（10倍或者100倍）。

2） 本品中含有荧光染料Sybr Green I，保存本品或配制PCR反应液时应避免强光照射。

3） 通常推荐引物浓度为0.2 μM，就可以得到较好的结果，反应效果不佳时可在0.1 - 1.0 μM范围内进行调整。扩增效率不高的情况下，可提高引物浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。

4. qPCR反应程序

注意：

1） 绝大多数情况下，使用二步法或三步法均可获得良好效果。二步法扩增特异性高，三步法扩增效率高。如果融链曲线较差，可以尝试两步法扩增或提高退火温度；如果因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试加长延伸时间或者进行三步法PCR扩增。

2） 根据引物的Tm值进行退火&延伸（退火）温度的设定；

3） 延伸（退火&延伸）时间的设置还需要根据您所使用的qPCR仪所需要的最短数据采集时间自行调整。

4） 融解曲线分析请以所使用的荧光定量PCR仪推荐的程序进行设定。