miRNA RT-qPCR Detection kit

miRNA 反转录/荧光定量检测试剂盒（All In One）

目录号:71613

产品内容

保存条件

-20℃保存，有效期 12 个月。

产品简介

本产品包含25 rxns (20 μl/rxn) 的miRNA逆转录（加尾法）和500 rxns (20 μl/rxn)的2x miRNA qPCR Mix。

本产品采用 Poly（A）加尾法，以 miRNA 为模板，采用特殊优化预混合 miRNA RT Enzyme mix（包含Poly(A)加尾酶和反转录酶）将 Poly(A)加尾和反转录一步法高效完成 miRNA 对应的 cDNA 合成；miRNA 检测使用 2 x miRNA qPCR Mix（含有通用型 ROX）。适用于 Total RNA 或者 small RNA 等包含 miRNA 的样品。

操作步骤：

一、miRNA 3’末端进行Poly (A)加尾 和 逆转录反应（第一链合成）

1. 冰上，在 RNase-Free PCR 管中，加入以下组分：(先加其他组分，最后再加入 miRNA RT Enzyme Mix)

注意事项：miRNA RT Enzyme Mix非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外，导致损失，用前请点甩离心，并且避免吸头外壁沾附损失。Enzyme Mix内酶都是过量的，即使每次按照 1.8μl使用，也不影响使用效果。

*在反应中使用的total RNA 必须包含有小分子RNA(miRNA)。此过程也可以使用富集的miRNA，单纯miRNA无法直接用分光光度计定量，建议直接加入2μl ~5μl。可根据目的miRNA丰度决定加入量，但是对于低丰度miRNA 样品而言(如血清血浆提取物)，可直接加入最大体积8 μl。

2. 轻柔吸打混匀，点甩离心，42℃孵育60 min，进行miRNA加尾和逆转录反应。

3. 85℃加热5 sec，终止反应。合成的cDNA反应液可放置于-20°C保存；也可以直接进行下游qPCR检测。

二、进行miRNA的荧光定量检测。

Forward Primer设计原则：(上游引物需要自备）

1. 遵循引物设计的最普遍原则。

2. 以成熟的miRNA 序列为基础，将U替换成T，这是最基础和最简单的设计方法。

3. 试剂盒中提供的下游引物的Tm 值为65℃，设计上游引物的Tm 值要尽量保证在65℃左右。

4. 若按照原则2 的方式直接设计的引物其Tm 值过低，可以在引物的5’端添加几个碱基（最好为G 或C 碱基）；也可以在3’端添加1个或几个A碱基；或者5’端和3’端同时修饰。

5. 若按照原则2 的方式直接设计的引物其Tm 值过高，可以在引物的5’或3’端去掉几个碱基。

操作步骤：

1. 冰上配制qPCR反应体系：（以20μl反应体系为例）

1） 推荐模板加样量为1-2μl，miRNA 第一链cDNA不应超过总反应体系的10%，对于特殊的检测体系中，高含量的cDNA模板易导致非特异性扩增，根据所检测miRNA的丰度适当的稀释cDNA（10倍或者100倍）。

2） 通常推荐引物浓度为0.2 μM，就可以得到较好的结果，反应效果不佳时可在0.1 - 1.0 μM范围内进行调整。扩增效率不高的情况下，可提高引物浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。

2. qPCR反应程序

二步法特异性高，三步法扩增效率高。

如果融链曲线较差，可以尝试两步法扩增或提高退火温度；如果因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试加长延伸时间或者进行三步法PCR扩增。