2x miRNAUniversal SYBR qPCR Mix (茎环法)
目录号:71501
产品内容
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Components |
71501-500 500 rxns(20 μl/rxn) |
71501-2500 2500 rxns(20 μl/rxn) |
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2x miRNA Universal SYBRqPCR Mix |
1 ml x5 |
1 ml x25 |
保存条件
-20℃保存，有效期 24 个月。
使用前，充分融解，轻轻颠倒混匀，短期使用可放在 4 ℃，避免反复冻融。
产品简介
2x miRNA Universal SYBR qPCR Mix（茎环法）是专门为茎环法miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂，其中的DNA polymerase 采用的是抗体修饰的热启动形式， 配合特殊的Buffer 体系，使反应特异性更好，灵敏度更高，并能在更广的范围内进行准确定量。
预混液中含有通用型ROX，适用于所有qPCR仪，使用qPCR Mix时不需要额外添加ROX来校正仪器。
需要自备的试剂：
待检测miRNA对应的qPCR的引物
Realtime 上游引物设计：
miRNA序列除去3’端6个碱基 的剩余部分作为上游引物，如miR-1的上游引物为(注意 把U改为T)：TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm 值（一般参考DNAMAN），如果Tm值较低，则在5’端加GC使Tm值接近60度。因此miR-1的上游引物可设计 为：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。
下游引物是通用的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。
引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将PCR产物进行电泳检测产物是否单一（产物长度很短，需要3%以上的琼脂糖胶）
操作步骤：
1. 在室温融化2x miRNA qPCR Mix、primer（10μM）、DNA模板、ddH2O，并置于冰上备用。
2. 冰上配制qPCR反应体系：（以20μl反应体系为例）
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Components |
Volume (20μl) |
Final Concentration |
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2x miRNA Universal SYBR qPCR Mix |
10 μl |
1× |
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DNA Template |
Variable |
As required |
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Forward Primer (10μM) |
0.4 μl |
0.2 μM each |
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Reverse Primer (10μM) |
0.4 μl |
0.2 μM each |
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ddH2O |
Up to 20 μl |
Not applicable |
1） 推荐模板加样量为1-2μl / 20μl反应体系，cDNA原液≤总反应体系的10%。
2） 对于特殊的检测体系中，高含量的cDNA 模板易导致非特异性扩增，根据所检测miRNA 的丰度适当的稀释cDNA（10倍或者100倍）。
3） 通常推荐引物浓度为0.2 μM，就可以得到较好的结果，反应效果不佳时可在0.1 - 1.0 μM范围内进行调整。
扩增效率不高的情况下，可提高引物浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。
3. qPCR反应程序
注意：
1） 本产品兼容性强，绝大多数情况下使用二步法和三步法均可获得良好效果。一般来说，二步法扩增特异性高，三步法扩增效率高。如果融链曲线较差，可以尝试两步法扩增或提高退火温度；如果因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试加长延伸时间或者进行三步法PCR扩增。
2） 根据引物的Tm值进行退火&延伸（退火）温度的设定；
3） 延伸（退火&延伸）时间的设置还需要根据您所使用的qPCR仪所需要的最短数据采集时间自行调整。
4） 融解曲线分析请以所使用的荧光定量PCR仪推荐的程序进行设定。