Total RNA Extraction Reagent (Trizol)
目录号：NAET01
储存条件：2~8℃保存12个月。
产品内容：
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组分 |
T01 |
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Total RNA Extraction Reagent (Trizol) |
100 mL |
产品简介
Total RNA Extraction Reagent (Trizol) 是一种包含酚/异硫氰酸胍等物质的总RNA提取试剂，该试剂可迅速裂解组织和细胞样本释放出核酸，有效抑制核酸酶活性从而保证RNA的完整性。本产品适用于从人、动物、植物、真菌、细菌等各种组织或细胞中快速分离总RNA，在保证RNA纯度高、完整性好的同时最大限度的去除了蛋白质和基因组DNA等杂质，提取流程可在1 h内完成，产物可直接用于RT-PCR、NorthernBlot、体外翻译等实验。
产品特点
适用范围广；
操作简单快速，整个过程可在1 h内完成；
纯度高、污染少。
注意事项
Total RNA Extraction Reagent (Trizol) 是强腐蚀性物质，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。
使用方法
试剂准备
1. 自备试剂：无水乙醇、氯仿、异丙醇等。
2. 去酶处理：RNase是导致RNA降解最主要的物质，必须使用RNase-free的实验器具，包括枪头和离心管，并且RNA实验用的器具需专门使用，避免交叉污染。
3. 样品保存：匀浆后，加氯仿前，样品可在-80°C放置一个月以上；提取的RNA样品可以在70% 酒精中-20°C保存2个星期以上；如需长期保存，请置超低温冰箱中保存。
样本准备
1. 动物/植物组织
取新鲜组织样品在液氮中速冻后转移至研钵中迅速充分研磨，期间可补充液氮并研磨直至样本呈粉末状，随后以50~100 mg样本使用1 mL Total RNA Extraction Reagent比例匀浆处理
*样品体积一般不要超过Total RNA Extraction Reagent体积的10%。
2. 贴壁细胞
2.1 直接裂解法：倒出培养液，用1×PBS清洗1次后在培养板中加入Total RNA Extraction Reagent直接裂解细胞，或直接在培养板中加入Total RNA Extraction Reagent裂解细胞，每10 cm2培养面积生长的细胞加1 mL Total RNA Extraction Reagent。用移液器反复吹打混匀直至无明显沉淀。
*培养面积不超过10 cm2，细胞不超过1×107。
2.2 胰蛋白酶处理法：收集细胞并大致确定细胞数量，用PBS洗涤后，向细胞中加入含有0.1-0.25% 胰蛋白酶的PBS处理细胞，当细胞脱离容器壁后，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至无RNase的离心管中，8,000 rpm离心5 min，收集细胞沉淀并去除上清。每10 cm2面积加1 mL Total RNA Extraction Reagent。用移液器吹打混匀。
3. 细胞悬液
离心收集细胞。每5×106-107动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加入1 mL Total RNA Extraction Reagent。
*加入Total RNA Extraction Reagent前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。
*对于难以裂解的酵母和革兰氏阳性菌需要液氮研磨或匀浆器匀浆。
4. 血液
取0.5 mL新鲜或冻溶的血液，12,000 rpm离心5 min，去除血浆后加入1 mL Total RNA Extraction Reagent，充分振荡混匀。
RNA抽提步骤
1. 将上述裂解液或匀浆液室温静置5-10 min使蛋白和核酸充分分离；
2. 向上述裂解液或匀浆液中加入1/5 Total RNA Extraction Reagent体积的氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 s，溶液呈乳浊状，室温静置5 min；
* 彻底混合有利于后续的相分离。
3. 12,000 rpm 4℃离心10~15 min。此时样品分为3层，即上层无色的水相（含RNA）、中间层和下层有机相。
4. 小心吸取上层水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇上下颠倒充分混匀，室温放置10~20 min；
* 水相体积约占Total RNA Extraction Reagent体积的60%，建议吸取400 μL左右，避免吸取到中间层导致基因组DNA的污染。
5. 12,000 rpm 4℃离心10 min，去上清，此时管底会出现白色胶状沉淀；
6.使用1 mL 75% 乙醇 (用RNase-free水配制) 洗涤沉淀。12,000 rpm 4℃离心5min，弃去上清；
7. 重复步骤6；
8. 室温晾干5~10 min。加入30~50 μL的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液器轻轻吹打或在55~60℃孵育5~10 min。待沉淀完全溶解后将所得到的RNA溶液置于-80°C保存或用于后续试验。
RNA的分析和定量
1. 测定样品在260 nm和280 nm的吸收值确定RNA纯度，按1 OD=40 µg RNA计算RNA的产率。
* OD260/280 在1.8-2.0视为抽提RNA的纯度很高。
2. 进行甲醛变性琼脂糖电泳，确定RNA的完整性和污染情况。
常见问题分析
1. 提取的RNA量较少
1) 取样量少。
2) 样品裂解或匀浆处理不彻底，RNA没有被完全释放。
3) 得到的RNA沉淀未完全溶解。
2. RNA样品的260/ 280比值小于1.6
1) 样本匀浆或裂解时Total RNA Extraction Reagent较少或加入试剂后未室温放置5 min导致RNA与蛋白质、DNA未充分分离。
2) 水相中混有有机相，从而有蛋白质和DNA污染。
3) RNA未用水溶解，在TE这种低离子浓度和低pH条件下，A280值会偏高。
4) 抽提得到的RNA沉淀未完全溶解。
3. 提取RNA样品发生部分或完全降解
1) 所用组织或细胞保存不当，样品没有及时用液氮冻存，导致组织或细胞中的RNA降解。
2) 细胞在胰蛋白酶时消化过长，导致加Total RNA Extraction Reagent前RNA已经部分降解。
3) 溶液或离心管等耗材未经RNase处理，RNase的污染导致RNA被降解。
4. RNA样品中存在DNA污染
1) 样品匀浆时加的试剂体积太少。
2) 样品中含组织溶剂（如乙醇等）或碱性溶液，致水相减少或pH升高。