HiPure Yeast Plasmid Mini Kit

酵母高纯度质粒大量快速提试剂盒

目录号：31119-10

产品内容：

保存条件：

在室温(15 ~ 25℃)干燥条件下，可保存 12 个月。加入 RNase A 后的溶液 P1 应置于 2 ~ 8℃

保存，可稳定保存 6 个月,如果 P1 中 RNase A 失活，重新补加即可。

产品简介：

本试剂盒用于高纯度酵母质粒 DNA 的小量制备。菌体经碱裂解、高盐、低 pH 处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心吸附柱吸附。通过清洗液的洗涤可去除杂质，在低盐、高 pH 条件下洗脱，最后得到纯度较高的质粒 DNA。所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、RT-qPCR、测序及转染等分子生物学实验。

注意事项：

1.        通常酵母的拷贝数都很低，高拷贝最大得率一般为每 5 ml 培养物提取 1 μg 左右的质粒。用于下游试验时通常建议使用量为：1-5 μl 用做 PCR 模板;5-10 μl 用于转化大肠杆菌,选择高效率的感受态细胞。

2.  用户需要自备 Sorbitol buffer( 1M 山梨醇， 0.1M Na2EDTA，14 mM β-巯基乙醇)。 配制方法：在 600 ml 去离子水里面溶解 182.2 克山梨醇，加入 200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要调节 PH 值，定容到 1L，4℃保存。临用前加 0.1%β-巯基乙醇(商品化的 β-巯基乙醇摩尔浓度一般为 14M)。

3.         使用前请先检查平衡液、溶液 YP2 和溶液 YP3 是否出现浑浊，如有混浊现象，可在 37℃

水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。

4.     溶液YP1，YP2 和YP3 的用量比例，若细菌量增大，需按比例放大这些溶液的使用量；

重要提示：

一、第一次使用前请先在去蛋白液 PD、漂洗液 WB 中加入指定量无水乙醇（见瓶身标签），充分混匀，并做好标记，以免多次加入。

二、首次使用时请先将 RNase A 全部加到溶液YP1 中，混匀，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存。三、吸取使用量的Sorbitol buffer 加入 0.1%β-巯基乙醇，回复到室温备用。

操作步骤：

1.   取 100 - 180 ml 酵母培养物，12,000 x g 离心 1 min，尽可能的吸弃上清，收集菌体。

（注意： 如果用 50ml 离心管收集菌体，可以离心弃上清后，在同一管内加入更多的菌液，重复步骤

1，直到收集到足够多的菌体）

2. 加入 10 ml Sorbitol buffer，轻柔吹打充分重悬细胞；加入 0.1 g Lyticase (Lyticase 临用前用 2ml Sorbitol buffer 溶解)，充分颠倒混匀，37℃温育 1 – 2 小时消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。

（注意：如果破壁效果不好导致质粒产量低，可以加大 lyicase 用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间来提高效果，不适合 Lyticase 消化的酵母可选用 Zymolase 或者其它方法如玻璃珠涡旋，反复冻融等。）

3.       12,000 x g 离心 2 min，尽可能吸弃上清，加入 7 ml 溶液YP1，重悬菌体沉淀，涡旋震

荡至彻底悬浮。

（注意：如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低）

4.  加入 7 ml 溶液YP2，温和地上下翻转 6-8 次，使菌体充分裂解，室温放置 4 min。

（注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组 DNA 片段的污染，所用时间不要超过 5 min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加溶液 P2 的用量，在后续的操作中溶液 YP3 的用量也要相应增加）

5.  加入 10 ml 溶液YP3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀，

然后室温 12,000 x g 离心 10 -15 min, 小心取上清，避免吸到白色漂浮物。

（注意：加入溶液 YP3 后应立即混合，避免产生 SDS 的局部沉淀,如果上清中还有白色漂浮物，可再次离心取上清）

6.        将上清液加入吸附柱中（吸附柱最大容量 10ml），室温 12,000 rpm 离心 1 min，质粒被

吸附在膜上，弃滤液。重复步骤直到上清全部被加入吸附柱。

7.        可选步骤：向吸附柱中加入 10 ml 去蛋白液 PD，室温 12,000 x g 离心 1 min，弃滤液。

8.  加入 10 ml 漂洗液 WB，室温 12,000 x g 离心 1 min，弃滤液。

（注意：漂洗液 WB 为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防酒精挥发）

9. 重复步骤 8 一次。

10.      室温 12,000 x g 离心 2 min，甩干膜上残留乙醇。打开盖子室温晾干 2 – 3 min。

（注意：此步不能省略，否则残留乙醇会影响质粒的后续使用）

11.     将吸附柱置于一个新的 50 ml 离心管（自备）中，加入 0.6 - 1ml 的洗脱缓冲液EB，室温放置 2 min，12,000 rpm 离心 2 min，离心管底溶液即质粒 DNA。

（注意：事先在 65~70℃水浴中预热洗脱缓冲液 EB，可增加洗脱效率；如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，再次离心 1 min 收集；如需使用去离子水洗脱，可用 NaOH 调整其 pH值在 7.0 - 8.5 之间。）