EndoFree Plasmid Maxi Kit

无内毒素质粒大提试剂盒

目录号：31112-10

产品内容：

保存条件：

在室温(15 ~ 25℃)干燥条件下，可保存 12 个月。

RNase A 可常温运输，-20℃保存。

产品简介：

无内素质粒大量提取试剂盒可快速从 100-300ml 菌液中提取质粒，采用改进的 SDS-碱裂解法裂解细胞，然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒 DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、 RT-qPCR、测序及转染等分子生物学实验。

产品特点：

1.   内毒素含量低（< 10 EU/ug DNA），细胞转染效果好。

2.   得率高： 150 – 300 ml 菌液可提出多达 500– 2000 ug 的纯净质粒。

重要提示：

一、使用前请先检查平衡液、溶液 P2 和溶液 N3 是否出现浑浊，如有混浊现象，可在 37℃

水浴中加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

二、第一次使用前请先在去蛋白液 PE、漂洗液 WB 中加入指定量无水乙醇（见瓶身标签），充分混匀，并做好标记，以免多次加入。

三、首次使用时请先将 RNase A 全部加到溶液 P1 中，混匀，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存。

操作步骤：

1.取 150 ~ 200 ml（最多 300ml）过夜培养的菌液，室温 12,000 x g 离心 1 min，尽量倒干上清，收集菌体。

（注意： 如果用 50ml 离心管收集菌体，离心弃上清后，在同一管内加入更多的菌液，重复步骤 1，直到收集到足够多的菌体）

2. 加入 7.5 ml 溶液 P1，重悬菌体沉淀，涡旋震荡至彻底悬浮。

（注意：如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低）

3. 加入 7.5 ml 溶液 P2，温和地上下翻转 6-8 次，使菌体充分裂解，室温放置 4 min。

（注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组 DNA 片段的污染，所用时间不要超过 5 min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加溶液 P2 的用量，在后续的操作中溶液 P3 的用量也要相应增加）

4. 加入 7.5 ml 溶液N3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀，然后室温 12,000 x g 离心 10 ~ 15 min,小心取上清至新管。

（注意：加入溶液 P3 后应立即混合，避免产生 SDS 的局部沉淀）

5. 向上清中加入 0.5 倍体积的异丙醇（约 10 ml），充分颠倒混匀，分两次（每次不超过 10 ml）转入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000 x g 离心 1min，质粒被吸附在膜上，倒掉收集管中的滤液，直到所有混合溶液通过此吸附柱。

6.   可选步骤：向吸附柱中加入 10 ml 去蛋白液 PE，室温 12,000 x g 离心 1 min，弃滤液。

（注意：去蛋白液 PE 为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防酒精挥发）

（注意：如果宿主菌是 endA-，如 DH5α或 TOP10，此步骤可省略。如果宿主菌是 endA+，如 TG1、BL21、 HB101、JM101 等，此步骤不可省略，因这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒。如果提取低拷贝质粒也推荐采用此步骤）

7.  加入 10 ml 漂洗液 WB，室温 12,000 x g 离心 1 min，弃滤液。

（注意：漂洗液 WB 为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防酒精挥发）

8.  重复步骤 10 一次。

9.  将吸附柱放进收集管，室温 12,000 x g 离心 3 min，甩干膜上残留乙醇。开盖室温晾干3 min，以免残留乙醇影响下游应用。

10. 将吸附柱置于一个新的 50 ml 离心管（自备）中，加入 1 ~ 2 ml 的洗脱缓冲液EB，室温放置 2 min，12,000 rpm 离心 2 min，离心管底溶液即质粒 DNA。

（注意：事先在 65~70℃水浴中预热洗脱缓冲液 EB，可增加洗脱效率；如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，再次离心 1 min 收集；如需使用去离子水洗脱，可用 NaOH 调整其 pH 值在 7.0 - 8.5 之间。）