EndoFree Plasmid Midi Kit
无内毒素质粒中量提试剂盒（溶液型）
目录号：31018
产品内容：
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产品组成 |
保存 |
31018-20 |
31018-40 |
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RNase A (10 mg/ml) |
-20℃ |
0.75 ml |
1.3 ml |
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内毒素清除剂 |
-20℃ |
5 ml |
10 ml |
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溶液 P1 |
室温 |
65 ml |
130 ml |
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溶液 P2 |
室温 |
50 ml |
100 ml |
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溶液 PIII |
室温 |
50 ml |
110 ml |
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杂质清除剂 A |
室温 |
1.5 ml |
3 ml |
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杂质清除剂 B |
室温 |
15 ml |
30 ml |
保存条件：
在室温 (15 ~ 25℃) 条件下，可保存 12 个月。
RNase A、内毒素清除剂，可常温运输，-20℃保存。
适用范围：
特别适合用于中量转染级质粒的制备，以及BAC/PAC 等大型质粒的制备。
产品简介：
采用独特的溶液配方和内毒素清除试剂，只需要几次简单的离心，就可以去除蛋白质、多糖、内毒素、RNA 等杂质，获得高质量的转染级质粒 DNA，可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对 DNA 纯度要求很高的工作中。
本方法提取纯化质粒 DNA，对质粒损伤小，即使是 10kb 甚至 100kb 以上的大型质粒或超大型 BAC/PAC 质粒，都可以有效纯化。获得的质粒产量高，浓度可高达 5ug /ul，超螺旋比例可高达 95%，内毒素<0.1 EU/ug，细胞转染效果极佳。
重要提示：
一、环境温度低时溶液 P2 中 SDS 可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在 37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
二、提取大质粒时, 操作动作要轻柔，剪掉一部分吸头的尖嘴，以增大开口，防止机械剪切对 DNA 的损坏。
三、提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加 P1、P2、PIII 的用量。
四、得到的质粒 DNA 电泳时可能为单一条带，也可能为 2 条或者多条 DNA 条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过 95%。
五、首次使用时请先将 RNase A 全部加到溶液 P1 中，混匀，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存。
操作步骤：
1. 取 40-60 ml（最多 90ml）过夜培养的菌液，装入 50ml 离心管中，12,000 x g 于 4℃离心2 min，尽量倒干上清，收集菌体。
（注意： 如果需要收集更多的菌体，离心弃上清后，在同一管内加入更多的菌液，重复步骤 1，直到收集到足够多的菌体）
2. 加入 2.5 ml 溶液 P1，重悬菌体沉淀，涡旋震荡至彻底悬浮, 室温放置 3 ~ 5 分钟。
（注意：如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低）
3. 加入 2.5 ml 溶液 P2，温和地上下翻转 6-8 次，使菌体充分裂解，室温放置 4 min。
（注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组 DNA 片段的污染，所用时间不要超过 5 min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加溶液 P2 的用量，在后续的操作中溶液 P3 的用量也要相应增加）
4. 加入 2.5 ml 溶液PIII，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀，至白色絮状物产生，然后 12,000 x g 于 4℃离心 10 ~ 15 min, 小心取上清，移入新的 50 ml 离心管中。
（注意：加入溶液 P3 后应立即混合，避免产生 SDS 的局部沉淀）
5. 加入 5 ml 异丙醇，上下颠倒离心管，充分混匀。
6. 在 4℃条件下 12,000~16,000 x g 离心 10 min，小心弃去上清，倒置轻轻沥干残余液体，加入 3-5 ml 70%乙醇漂洗一遍，最高速离心 5 分钟，弃上清，晾干沉淀。
（注意：DNA 沉淀如果干燥过头，DNA 将无法完全溶解，但是如果乙醇没有晾干挥发干净，残留太多，也会造成 DNA 无法完全溶解。）
7. 加入 0.7 ml 溶液P1 完全溶解沉淀团块，注意附着在侧壁上的质粒沉淀虽然看不见，也要吹打侧壁涮洗下来（大质粒可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解）。然后将质粒溶液转入新的 1.5 ml 离心管中。
8. 可选步骤（一般不需要）：如果菌株 RNA 丰富有微量 RNA 残留，可在此步骤后将质粒溶液 60℃孵育 15 min 消化 RNA。
9.每管加入 55 ul 杂质清除液 A，颠倒充分混匀后, 加入约 0.1 体积 (约 80ul ) 冰预冷的内毒素清除剂，颠倒旋转 7-10 次（30 秒左右）充分混匀，上清会变得浑浊，冰浴或者冰上放置>=5 min，中间偶尔颠倒混匀几次，上清恢复清亮。
(注意：如果不需要去内毒素用于转染，可在此步骤只加入 55 ul 杂质清除液A，充分混匀后冰上放置 5 分钟，离心后小心取上清转入一个新管，直接接步骤 12。)
10. 42℃水浴，溶液又会变为浑浊，颠倒混匀后 42℃温育 5 分钟。
11. 室温 14,000 x g 离心 5 min 分相，上层水相含 DNA，下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA 的上层水相转移到新管（注意不要吸到蓝色油状层，里面含内毒素等杂质），弃油状层。
溶液必须分为上下两相，否则应重复步骤 10-11。
（温度低时，内毒素清除剂无法分相，因此必须 20℃以上室温离心或者保证冬季转头温度 20℃以上）
12. 将上一步所得上层水相中加入等体积杂质清除液B（约 750 ul），轻柔混匀，4℃条件下14,000 x g 离心 10 min，弃上清（注意不要丢失 DNA），轻轻加入 1 ml 70%乙醇洗涤，离心弃上清，再用 1 ml 70%乙醇洗涤一次，室温倒置晾干 5~10 min 使乙醇完全挥发。
13. 每个离心管加 50~100 ul 纯水或者 TE 溶解沉淀（可在 37℃水浴中振荡以辅助溶解）。要注意很多质粒 DNA 可能附着在离心管侧壁上，即使看不见，也应该充分吹打侧壁溶解回收质粒 DNA。（质粒 DNA 可以根据需要，选择任意小体积的纯水溶解，浓度可达 5-10ug/ul）