EndoFree Plasmid Maxi Kit

彩色无内毒素质粒大提试剂盒

目录号：31115-10

产品内容：

保存条件：

在室温(15 ~ 25℃)干燥条件下，可保存 12 个月。

RNase  A，可常温运输，-20℃保存。

产品简介：

本试剂盒用于无内毒素质粒 DNA 的大量制备，柱上去除内毒素，操作简单。菌体经改良的碱裂解处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心柱硅胶膜吸附。通过去蛋白液和漂洗液的清洗可去除蛋白及其他杂质，最后得到高纯度的无内毒素质粒 DNA，所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、测序、细胞转染等分子生物学实验。

小质粒（<10kb），拷贝数高，100ml 菌液通常能提到 500-1500ug 质粒；大质粒（>10kb），拷贝数低，200ml 菌液通常能提到 200-600ug 质粒。

产品特点：

1.        独特工艺配方清除内毒素，内毒素含量极低（< 1 EU/ug DNA），细胞转染效果极佳。

2.        得率高： 150 – 300 ml 菌液可提出多达 500– 2000 ug 的纯净质粒；

重要提示：

一、使用前检查 Solution II 和 Solution N3 是否出现沉淀，如有沉淀 37℃加热溶解后再用。

二、首次使用前，请先在 Buffer WB2 中加入无水乙醇（详见瓶身标签），混匀，并做好标记。

三、首次使用请先将 RNase A 全部加到 Solution I 中，混匀，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存。

操作步骤：

1. 柱平衡：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入 2.5 ml 的Buffer BL，10,000 rpm 离心 2 min，弃收集管中滤液，将吸附柱重新放回收集管中。

2.取 100 ~ 150 ml（最多 200 ml）过夜培养的菌液，室温 10,000 rpm 离心 2 min，弃上清，收集菌体。

（注意： 如果菌液浓度高，收集 100ml 的菌体即可,菌液浓度低，收集 150-200ml 菌液。）

3.加入 10 ml Solution I，重悬菌体沉淀，涡旋震荡至彻底悬浮，呈现出均匀浑浊的棕红色。

（注意：如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低）

4.加入 10 ml Solution II，颠倒混匀使菌体完全裂解，直到溶液变清亮、粘稠的紫红色。

（注意：不可 Votex 剧烈震荡，以免造成基因组 DNA 片段的污染，所用时间不要超过 5 min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加 Solution II 的用量，在后续的操作中 Solution N3 的用量也要相应增加）

5.加入 10 ml Solution N3，立即温和颠倒混匀，可见红黄相间的絮状物产生，继续混匀直

到完全变为黄色，静置 2 min，然后室温 10,000 rpm 离心 10 min，小心取上清至新管。

（注意：离心后在最上层可能会出现一层漂浮膜，注意不要倒入吸附柱）

6.   加入 0.3 倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀。分两次（每次不超过 10 ml）转入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），10,000 rpm 离心 1 min，质粒被吸附在膜上，弃滤液，直到所有混合溶液通过此吸附柱。

7.   向吸附柱中加入 5 ml ToxinOut Buffer，室温 10,000 rpm 离心 1 min，弃滤液。

8.加入 10 ml Buffer WB2，室温 10,000 rpm 离心 1 min，弃滤液。

（注意：Buffer WB2 为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防酒精挥发）

9.加入 5 ml Buffer WB2，室温 10,000 rpm 离心 1 min，弃滤液。

10.  将吸附柱放进收集管，室温 10,000 rpm 离心 5 min，甩干膜上残留乙醇。

11.将吸附柱置于一个新的 50 ml 离心管（自备）中，打开管盖，室温晾干 5 min，以免残留乙醇影响下游应用。

12. 加入 1 ~ 2 ml 的洗脱液Buffer EB，室温放置 2 min，12,000 rpm 离心 2 min，离心管底溶液即质粒 DNA。

（注意：事先在 65~70℃水浴中预热洗脱缓冲液 EB，可增加洗脱效率；

如果需要较多量质粒，可将得到的质粒溶液重新加入吸附柱中，重复收集 3 次，可获得最大洗脱率；如需使用去离子水洗脱，可用 NaOH 调整其 pH 值在 7.0 - 8.5 之间。）