FlashPure Plus Bacteria Total RNA Mini Kit
细菌总 RNA 快速提取试剂盒（含 gDNA 过滤器）
目录号：91413
产品内容
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产品成份 |
91413-50 |
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溶菌酶 |
20 mg |
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TE (PH 8.0) |
6 ml |
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裂解液 BRL Plus |
25 ml |
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去蛋白液 RW1 |
40 ml |
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漂洗液 RW |
10 ml（需加入指定量无水乙醇） |
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70%乙醇 |
9 ml（需加入指定量无水乙醇） |
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RNase-Free H2O |
10 ml |
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gDNA 过滤器和收集管 |
50 套 |
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RNA 吸附柱和收集管 |
50 套 |
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RNase-Free 1.5 ml 离心管 |
50 支 |
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RNase-Free 2.0 ml 液氮研磨管 |
50 支 |
自备试剂
无水乙醇
保存条件
溶菌酶，常温运输， 4℃保存；其他组分，室温（15 ~ 25℃）保存。
产品简介
FlashPure Bacteria Total RNA Mini Kit 是专用于提取细菌（G+、G-）的总 RNA，采用高效的 gDNA 过滤器，不需要繁琐的 DNase I 消化过程。得到的 RNA，可直接用于 RT、RT-PCR、RT-qPCR、RACE、测序、芯片等。
产品特点
1. 无毒：免氯仿、免β-巯基乙醇！
2. 高质：28s/18s=2:1，OD260/280=2.0～2.2！
3. 高效：提取全过程仅需 10 min！
重要提示：
① 第一次使用前，请先在漂洗液 RW 中加入无水乙醇，详见瓶身的标签。
② 每次操作前，请先配制添加了溶菌酶或者 Lysostaphin 的 TE (PH 8.0)，终浓度为 1mg/ml。
③ 所有离心步骤均需要在室温（15~25℃）下进行。
操作步骤：
1. 离心收集 1 ~ 2 ml 菌液（108 ~109细胞）到一个 1.5 ml 离心管, 彻底吸弃上清。
2. 根据细胞的种类和数量，充分重悬细胞在 100 μl (5x108细胞) / 200 μl
( 5x108~7.5x108 细胞 ) TE 中（确保溶菌酶或者 Lysostaphin 已添加至 TE 中，浓度为 1mg/ml )，或者直接用 TE 重悬后，用干净枪头挑取少许溶菌酶加入。
3. 室温(15~25℃)温育5min/溶菌酶, 或者37℃温育15min/ Lysostaphin，破解细胞壁。每 2 min 涡旋振荡 10 sec，帮助破壁。
注意：各种细菌破壁的难易程度不一样，一般革兰氏阴性菌 E.coli 使用上面的条件就足够了，,甚至可能省略该步骤，但是某些革兰氏阳性菌如B. subtilis 难破壁需要提高溶菌酶浓度到 15mg/ml 和温育时间到10min。如果金黄色葡萄球菌需要加入 lysostaphin 到 1mg/ml，37℃温育 15min。总之不同细菌类型破壁难易程度不同，有的难破壁的种类需要根据用户自己的具体情况调节酶的种类、工作浓度和温育温度、时间，此外还可以联合使用玻璃珠击打，机械破壁，蛋白酶 K 消化等方法帮助破壁。
4. 短暂离心收集细菌，彻底吸弃上清后，加入 500 μl 裂解液 BRL Plus，涡旋震荡或者反复吹打，裂解细菌。
5. 将裂解匀浆液全部加到 gDNA 过滤器中（过滤器放入收集管中），13,000 rpm 离心 1 min，保留滤液，（RNA 在滤液中）。
6. 向滤液中加入等体积（通常为 500 μl）的 70%乙醇，立即吹打混匀。
7. 每次转移≤750 μl 滤液混合物至 RNA 吸附柱中（吸附柱放入收集管)，13,000 rpm 离心 1 min，倒弃滤液。此时，RNA 被吸附在膜上，重复此过程，直到溶液全部上柱。
8. 加入 700 μl 去蛋白液 RW1,室温放置 1min,13,000 rpm 离心 30 sec，倒弃滤液。
9. 加入 500 μl 漂洗液 RW，13,000 rpm 离心 30 sec，倒弃滤液。
10. 重复步骤 7。
11. 把 RNA 吸附柱放回收集管中，13,000 rpm 离心 2 min，彻底除去膜上的乙醇。
12. 取出 RNA 吸附柱，放入新的 RNase-free 1.5 ml 离心管中，向吸附膜的中央部位悬空滴加 30-50μl RNase-Free H2O（事先在 70-90℃水浴中加热可提高产量），室温放置 1 min，13,000 rpm 离心 1 min。
13. 得到的 RNA，可直接用于下游实验，或于-70℃保存，以免降解。
附录：
一、免液氮直接研磨（自动研磨仪）——适用于新鲜样本
a. 在 2.0 ml 液氮研磨管中加入 4 mm 两粒，加 600 μl 裂解液 ARL plus，放进 20 mg 左右的样本，设置 65 个频率，震荡 2 min。
b. 将裂解物 13,000 rpm 离心 3 min，沉淀不能裂解的碎片。
二、液氮研磨（自动研磨仪）:
a. 把研磨模块丢到液氮中预冷，直到没有气泡冒出视为预冷完毕。
b. 在 2.0 ml 液氮研磨管中放入 3mm 钢珠 3 粒，放进 20-30mg 样本，
投入液氮中预冷。
c. 把预冷好的离心管插入研磨模块中，放进研磨仪，设置 55 个频率，震荡 30~60 sec。（以北京赫得研磨仪——京 N9548 为例）
d. 研磨完成后，马上加 600 μl 裂解液 ARL Plus，剧烈涡旋振荡,充分混匀。
e. 将裂解物 13,000 rpm 离心 3 min，沉淀不能裂解的碎片。
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