Yeast Total RNA Mini Kit
酵母总 RNA 快速提取试剂盒
目录号：91110
产品内容
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产品成份 |
保存 |
91110-50（50 次） |
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缓冲液 SE |
室温 |
15 ml |
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Lytic Enzyme |
-20℃ |
2.5 ml |
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裂解液 RLT |
室温 |
20 ml |
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去蛋白液 RW1 |
室温 |
40 ml |
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漂洗液 RW |
室温 |
10 ml（需加入指定量无水乙醇） |
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RNase-Free H2O |
室温 |
10 ml |
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RNA 吸附柱和收集管 |
室温 |
50 套 |
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RNase-Free 1.5 ml 离心管 |
室温 |
50 支 |
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RNase-Free 2.0 ml 液氮研磨管 |
室温 |
50 支 |
自备试剂
无水乙醇、β-巯基乙醇
产品简介
适用于从酵母样本中提取总RNA，提取的RNA可直接用于RT，RT-PCR，RT-qPCR，普通转录组测序、RACE等。
产品特点
1. 高质：28s/18s=2:1，OD260/280=2.0～2.2！
2. 高效：提取全过程仅需 30 min！
操作步骤
① 第一次使用前，请先在漂洗液 RW，详见瓶身的标签。
②操作前，在裂解液 RLT 中加入 1% 的 β-巯基乙醇，例如 1ml RLT 中加入10 μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的 RLT 可在 4℃放 30 天。
③吸取使用量的缓冲液 SE 加入β-巯基乙醇至终浓度 0.2%，备用。
提示：所有离心步骤必须在室温（15~25℃）下进行。
1. 小量酵母培养细胞：
a．收集 1 ml（约 107细胞）处于对数生长期酵母培养物到 1.5 ml 离心管，12,000 rpm 离心30sec，尽可能吸弃上清。
b．加入100μl缓冲液SE中（确认已经加入 0.2% β-巯基乙醇），轻柔吹打充分重悬细胞；根据酵母量加入约 20 μl Lytic Enzyme 储液，充分颠倒混匀，37℃温育 15~30 min 消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。
注意：如果破壁效果不好导致产量低，可以加大 lytic Enzyme 用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间或者提高温度到 45℃来提高效果，不适合 Lytic Enzyme 消化的酵母可选用其它方法如0.5mm 玻璃珠涡旋击打 ，反复冻融等。
c．加入 380 μl 裂解液 RLT（确认已加入 1% β-巯基乙醇），吹打混匀后用手剧烈振荡 20 sec，充分裂解。
注意：一般加入裂解液后充分涡旋吹打后应该见不到明显团块或者不溶物,极少数情况下如果有明显团块或者不溶物可以将裂解物13,000rpm 离心 3 min,沉淀不能裂解的碎片或者不溶物, 将裂解物上清全部转到一个新离心管再进行下一步。
d．加入 280 μl 无水 乙醇，立即吹打混匀，不要离心。
e．下接步骤 3。
2. 中量酵母培养细胞：
a． 收集 2~3 ml（约 3X107 细胞）处于对数生长期酵母培养物到 1.5 ml离心管（超过 1.5 ml 可分两次在同一个离心管内进行收集细胞），12，000rpm 离心30 sec，尽可能吸弃上清。
b． 加入300 μl缓冲液SE中（确认已经加入β-巯基乙醇至终浓度0.2%），轻柔吹打充分重悬细胞；根据酵母量加入 50μl Lytic Enzyme 储液，充分颠倒混匀，37℃温育 15~30 min 消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。
注意：如果破壁效果不好导致产量低，可以加大 lytic Enzyme 用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间或者提高温度到 45℃来提高效果，不适合Lytic Enzyme消化的酵母可选用其它方法如0.5mm玻璃珠涡旋击打 ，反复冻融等。
c． 13,000 rpm 离心 1 min，尽可能吸弃上清。
d． 加入 350μl 裂解液 RLT（确认已经加入 β-巯基乙醇至终浓度 1%），吹打混匀后用手剧烈振荡 20 sec，充分裂解。
注意：一般加入裂解液、充分涡旋吹打后，应该见不到明显团块或者不溶物。极少数情况下，如果有明显团块或者不溶物，可以将裂解物13,000 rpm 离心 3 min，沉淀不能裂解的碎片或者不溶物, 将裂解物上清全部转到一个新离心管再进行下一步。
e． 加入等体积 70％乙醇（DEPC 水配制，约 350μl）立即吹打混匀。
f． 下接步骤 3。
3. 将≤750μl 上清混合液加入 RNA 吸附柱中，13,000 rpm 离心 1 min，
倒弃滤液。此时，RNA 被吸附在膜上。重复此过程，直到溶液全部上柱。
4. 加入 700 μl 去蛋白液 RW1，室温放置 1min，13,000 rpm 离心 30 sec，倒弃滤液。
5. 加入 500μl 漂洗液 RW，13,000 rpm 离心 30 sec，倒弃滤液。
6. 重复步骤 5 一次。
7. 将 RNA 吸附柱放回空收集管中，13,000 rpm 离心 2 min，除去乙醇。
8. 取出 RNA 吸附柱，放入 RNase-free1.5 ml 离心管中，向 RNA 吸附膜的中央部位悬空滴加30-50μl RNase-free H2O，室温放置 1 min，13,000 rpm 离心 1 min。
9. 提取的总 RNA，可直接用于下游实验，或于-70℃保存，以免降解。
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