Universal miRNA Mini Kit

通用型 microRNA 快速提取试剂盒

 

目录号：91015

产品内容

产品成份	91015-50（50 次）
裂解液 RL	50 ml
Wash Solution 1	12 ml（需加入指定量无水乙醇）
Wash Solution 2/3	10 ml（需加入指定量无水乙醇）
70%乙醇	9 ml（需加入指定量无水乙醇）
RNase-Free ddH2O	5 ml
RNA 吸附柱和收集管	50 套
microRNA 吸附柱和收集管	50 套
RNase-Free 1.5ml 离心管	50 支
RNase-Free 2.0ml 液氮研磨管	50 支

自备试剂

无水乙醇

保存条件

室温（15 ~ 25℃）

产品简介

裂解液 RL 是 RNAzol (Trizol )，配合 miRNA 专用的溶液体系，专用于快速提取各种细胞、动物、植物、真菌、昆虫、细菌、微生物等样品的 miRNA和其它各种小 RNA(15-30 nt)。

可以提出来包含 micoRNA 的总 RNA，用于 microRNA 的 RT、qPCR检测，以及全转录组测序等；根据需要，也可以一次性把 microRNA 和总 RNA（mRNA、tRNA、rRNA）分别提出来。

但是市场上常见的离心柱型的 RNA Kit/总 RNA Kit 不能有效吸附回收miRNA，Trizol 沉淀抽提法也不能有效沉淀回收 miRNA（生物通上有专题文章阐述）。

产品特点

1. 本公司生产的 Universal miRNA Kit 质量优异，可以完美替代 Qiagen 的miRNeasy Mini kit。

2. 可在常温下提取 RNA，不需要 4℃离心机；亦可以兼容 4℃离心机。

注意事项

1. 采集 RNA 样本时，把新鲜组织样本浸入 RNAsafe (RNA 样品保存液，Cat#91115-100)中，可在 37℃保存一天，可在 25℃保存一周，可在 4℃ 保存一个月，在-20℃或者–80℃长期保存。

2. 样品应避免反复冻融，否则会影响 RNA 的提取得率和质量。

3. 样品加入裂解液 RL（RNAzol）匀浆后，加氯仿前，样品可在–80℃保存一个月以上；提取过程中应使用不含 RNase 的吸头和器皿。

重要提示：

① 第一次使用前, 先在 Wash Solution 1、Wash Solution 2/3 中加入

指定量无水乙醇，详见瓶上的标签。

② 所有离心步骤均需要在室温（15~37℃）下进行，提取效果更佳！

操作步骤（可得到包含 miRNA 的总 RNA）

1. 材料处理：

a．组织（动物、植物、真菌）：将组织在液氮中磨成细粉。取适量细粉加

入 1 ml 裂解液 RL，剧烈涡旋震荡，充分混匀。

样品投入量：动物组织为 30~50 mg；植物/真菌为：50~100 mg。

b．单层贴壁培养细胞：吸去培养液，直接在培养皿/瓶中加入适量裂解液RL，每 10cm2 加 1ml 裂解液 RL，用移液器反复抽打几次，帮助裂解。

c． 悬浮细胞：离心收集细胞，吸弃上清，每 5×106个细胞加 1ml 裂解液RL。加裂解液 RL 前不要洗涤细胞，以免降解 RNA。

d．血液：取新鲜血液，加入 3 倍体积裂解液 RL，充分振荡混匀。（推荐0.25 ml 血液+0.75 ml 裂解液 RL）

2. 将裂解物在室温下放置 5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。

3. 加入 200μl 氯仿，剧烈振荡 15 秒，并在室温下放置 2 分钟，

4. 13,000 rpm 离心 10 分钟。

5. 吸取 500 μl 上清转入新的 2.0 ml 离心管中，加入 1.5 倍体积（750 μl）的无水乙醇，吹打混匀。

6. 每次转移≤750 μl上清混合液至RNA吸附柱中，12,000 rpm离心1 min，倒弃滤液。此时 RNA 被吸附在膜上，重复此过程，直到所有溶液都上柱。

7. 向 RNA 吸附柱内加入 700 μl Wash Solution 1（检查是否已加入乙醇），12,000 rpm 离心 1 min，倒弃滤液。

8. 向 RNA 吸附柱内加入 500 μl Wash Solution 2/3（是否已加入乙醇），12,000 rpm 离心 1 min，倒弃滤液。

9. 重复步骤 8 一次。

10. 将 RNA 吸附柱放回空收集管中，12,000 rpm 离心 2 min，除去乙醇。

11. 取出 RNA 吸附柱，放入新的 RNase-Free 1.5 ml 离心管中，向吸附膜的中央部位悬空滴加50~100μl RNase-Free ddH2O，室温放置1min，12,000rpm离心1min，管底即：包含microRNA的总RNA。

12. 得到的 RNA，可直接用于下游实验，或于-70℃保存，避免 RNA 降解。

附：microRNA 富集方法（仅仅提取 microRNA，不包含>200 nt 其它总RNA 成份。一般不推荐）

注意：当非特异扩增较多或者扩增背景较高时，可以尝试使用富集方法提取的microRNA。

1. 按照前面标准操作步骤 1 ~ 4 操作，直到得到上清。

2. 吸取 500 μl 上清至新的 2.0 ml 离心管，加入等体积 70％乙醇（必须是室温的），吹打混匀。

3. 吸取 700 μl 上清混合液，加入一个 RNA 吸附柱中，12,000 rpm 离心 1min，收集滤液。并将滤液转移至一个新的离心管，然后把 RNA 吸附柱放回空的收集管内，再加入剩下的混合物，离心，收集滤液。

此时，滤液含有 microRNA, RNA 吸附柱的膜上是去除了 microRNA 的总RNA（mRNA、tRNA、rRNA），如果有需要，可以按照前面标准操作步骤7－11 操作，漂洗、洗脱，得到去除了 microRNA 的总 RNA。

4. 较精确估计滤液体积，加入 0.65 倍体积无水乙醇（必须是室温的），吹打混匀，不要离心。

5. 将≤750 μl 滤液混合物加入 microRNA 吸附柱中， 12,000 rpm 离心 1min，micoRNA 被吸附在膜上，倒弃废液。重复此过程，直到所有滤液混合物都上柱。

6. 按照前面标准操作步骤 7－11 操作漂洗，洗脱得到富集的 microRNA。

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