FlashPure Bacteria miRNA Mini Kit

细菌 microRNA 快速提取试剂盒（免氯仿）

目录号：91613

产品内容

自备试剂

无水乙醇

保存条件

溶菌酶，常温运输， 4℃保存；其他组分，室温（15 ~ 25℃）保存。

产品简介

市场上常见的离心柱型的 RNA Kit/总 RNA Kit，不能有效吸附回收miRNA；Trizol 沉淀抽提法也不能有效沉淀回收全部 miRNA（生物通上有专题文章阐述）。

FlashPure Bacteria miRNA Mini Kit 是专用于提取各种植物组织的miRNA（包含 miRNA 的总 RNA），是通用型 microRNA 快速提取试剂盒（Cat#91015）的升级版，提取过程不再需要使用氯仿，并采用独有的 gDNA 过滤器，高效滤除基因组，得到包含 miRNA 的总 RNA，可直接用于 miRNA和 mRNA 的 RT、RT-PCR、RT-qPCR、RACE、芯片、测序等。

注意事项

1. 样品应避免反复冻融，否则会影响 RNA 的提取得率和质量。

2. 样品加入裂解液 BRL Plus 匀浆后，样品可在–80℃保存一个月以上。

重要提示：

① 第一次使用前, 请先在 Wash Solution 1、Wash Solution 2/3 中加入指定量无水乙醇，详见瓶身的标签。

② 每次操作前，请先配制添加了溶菌酶或者 Lysostaphin 的 TE (PH 8.0)，终浓度为 1mg/ml。

③ 所有离心步骤均需要在室温（15~37℃）下进行，提取效果更佳！

操作步骤（可得到包含 miRNA 的总 RNA）

1. 离心收集 1 ~ 2 ml 菌液（108 ~ 109细胞）到一个 1.5 ml 离心管, 尽可能彻底吸弃上清。

2. 根据细胞的种类和数量，充分重悬细胞在 100 μl（5x108细胞）/ 200 μl（5x108 ~7.5x108 细胞）TE 中（确保已添加溶菌酶或者 Lysostaphin 至TE 中，浓度为 1mg/ml )，或者直接用 TE 重悬后，用干净枪头挑取少许溶菌酶加入。

3. 室温(15~25℃)温育5min/溶菌酶, 或者37℃温育15min / Lysostaphin，破解细胞壁。每 2 min 涡旋振荡 10 sec，帮助破壁。

注意：各种细菌破壁的难易程度不一样，一般革兰氏阴性菌 E.coli 使用上面的条件就足够了，,甚至可能省略该步骤，但是某些革兰氏阳性菌如B. subtilis 难破壁需要提高溶菌酶浓度到 15mg/ml 和温育时间到10min。如果金黄色葡萄球菌需要加入 lysostaphin 到 1mg/ml，37℃温育 15min。总之不同细菌类型破壁难易程度不同，有的难破壁的种类

需要根据用户自己的具体情况调节酶的种类、工作浓度和温育温度、时间，此外还可以联合使用玻璃珠击打，机械破壁，蛋白酶 K 消化等方法帮助破壁。

4. 短暂离心收集细菌，彻底吸弃上清后，加入 500 μl 裂解液 BRL Plus，涡旋震荡或者吹打混匀，裂解细菌。

5. 物将裂解匀浆液全部加到 gDNA 过滤器中（过滤器放入收集管中），13,000 rpm 离心 1 min，保留滤液，（RNA/microRNA 在滤液中）。

6. 用移液器较精确估计滤液体积（一般 480 μl），向滤液中加入 1.25 倍体积(一般 600μl )的无水乙醇，吹打混匀。

7. 每次转移≤750 μl滤液混合物至RNA吸附柱中，13,000 rpm离心1min，此时，RNA 被吸附在膜上，弃滤液。重复此过程，直到溶液全部上柱。

8. 加入 700 μl Wash Solution 1（检查是否已加入乙醇），室温放置 1 min,13,000 rpm 离心 30 sec，弃滤液。

9. 加入 500 μl Wash Solution 2/3（检查是否已加入乙醇），13,000 rpm离心 30 sec，弃滤液。

10. 重复步骤 7。

11. 将 RNA 吸附柱放回空收集管中，13,000 rpm 离心 2 min，除去膜上残留的留乙醇。

12. 取出 RNA 吸附柱，放入一个 RNase-free 1.5 ml 离心管中，向吸附膜的中央悬空滴加 30-50 μl 的 RNase-free H2O，室温放置 1 min，13,000 rpm 离心 1 min，管底即包含 miRNA 的总 RNA。

附录：

microRNA 富集方法（仅仅提取 microRNA，不包含>200 nt 其它总 RNA成份。一般不推荐）

注意：当非特异扩增较多或者扩增背景较高时，可以尝试使用富集方法提取的 microRNA。

1. 按照前面步骤 1、2 操作，直到得到上清。

2. 转移上清（约 500 μl）至一个新的离心管中，加入 0.5 倍体积的无水乙醇（必须是室温的），吹打混匀。

3. 将混合液加入 gDNA 过滤器中，13,000 rpm 离心 1 min，收集滤液 （microRNA 在滤液中）。

此时，RNA吸附柱的膜上是去除了microRNA的总RNA（mRNA、tRNA、rRNA），如果有需要，可以按照前面标准操作步骤 6－10 操作，经漂洗、洗脱后，得到去除了 microRNA 的总 RNA。

4. 较精确估计滤液体积，加入等体积的无水乙醇（必须是室温的），吹打混匀，不要离心。

5. 每次转移≤750 μl滤液混合物至RNA吸附柱中，13,000 rpm离心1 min，micoRNA 被吸附在膜上，倒弃滤液。重复此过程，直到所有滤液混合物都上柱。

6. 按照前面标准操作步骤 6－10，经漂洗、洗脱后，得到 microRNA。

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