酵母基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)
目录号：40210
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目录编号 |
包装单位 |
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40210-50 |
50次 |
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40210-50-1 |
50次(带蛋白酶K) |
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40210-50-2 |
50次（带Lyticase） |
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40210-50-3 |
50次（带蛋白酶K，带Lyticase） |
v 适用范围：
适用于快速提取各种酵母基因组DNA
v 试剂盒组成、储存、稳定性：
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试剂盒组成 |
保存 |
50次 |
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缓冲液YB |
室温 |
20ml |
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结合液CB |
室温 |
11ml |
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抑制物去除液IR |
室温 |
25ml |
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漂洗液WB |
室温 |
15ml |
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第一次使用前按说明加指定量乙醇 |
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洗脱缓冲液EB |
室温 |
15ml |
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Lyticase 10U/μl |
室温 |
2500U |
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蛋白酶K粉（可选）20mg/ml |
室温 |
20mg |
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吸附柱AC |
室温 |
50个 |
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收集管（2ml） |
室温 |
50个 |
本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项:
1. 结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2. 为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状（20mg），收到后，可短暂离心后，加入1毫升灭菌水溶解配制成20mg/ml溶液，因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分装冻存，－20℃保存。
3. 为避免降低活性，方便运输，提供Lyticase(2500U)为冻干粉状，收到后，可短暂离心后，加入0.25毫升灭菌水溶解配制成10U/μl，因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分装冻存，－20℃保存。
4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
v 产品介绍：
该试剂盒采用DNA吸附柱和独有的溶液系统，适合于从多种来源的酵母培养物中快速简单地提取基因组DNA。约3ml处于指数生长期的酵母培养液一般一次抽提可纯化出10-15μg的高质量的基因组DNA。纯化DNA产物可直接用于PCR、酶切和杂交等实验。酵母细胞经lyticase处理去除细胞壁后，独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤， 抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。
v产品特点：
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
3. 快速，简捷，单个样品裂解后操作一般可在30分钟内完成。
4. 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，可直接用于PCR，Southern-blot和各种酶切反应。
v 注意事项：
1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2. 需要自备乙醇、异丙醇、 β-巯基乙醇。
3. 开始实验前将需要的水浴先预热到37℃和70℃备用。
4. 结合液CB 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5. 用户需要自备Sorbitol buffer( 1M 山梨醇， 0.1M Na2EDTA，14 mMβ-巯基乙醇)。配制方法：在600 ml 去离子水里面溶解 182.2克山梨醇，加入200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要调节PH值，定容到1L，4℃保存。临用前加0.1%β-巯基乙醇(商品化的β-巯基乙醇摩尔浓度一般为14M)。
6. 菌体浓度检测一般OD600值为1的时候,酿酒酵母细胞是1-2x107 cells/ml，由于菌种和分光度计不同即使同样细胞数量OD值变化也很大，以上仅供参考。
7. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保批pH大于7.5， pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在－20℃。DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。
v 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
提示：
ð 第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
ð 吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.1%β-巯基乙醇，回复到室温备用。
1. 取1-3毫升酵母培养物(不超过3X107 cells，最好是早对数生长期)，12,000rpm离心30秒，尽可能的吸弃上清，收集菌体。
收集超过1.5毫升菌液，可以离心弃上清后，在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。
2.加入600μl Sorbitol buffer，轻柔吹打充分重悬细胞；可按照20-50U/1x107cells的比例加入Lyticase(一般3 ml培养物可能需要加到150U)，充分颠倒混匀，37℃温育至少30分钟消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。
如果破壁效果不好导致DNA产量低，可以加大lyicase用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间来提高效果，不适合Lyticase消化的酵母可选用Zymolase或者其它方法如玻璃珠涡旋，煮沸，反复冻融等。
3. 13,000rpm离心1分钟，尽可能吸弃上清，加180μl 缓冲液YB充分重悬细胞团。
4. 加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀。
5. 将混合物放置在55℃水浴消化直到消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。
所需消化时间和酵母数量、种类和生长状态有关，一般15分钟即可，但是如果方便的话消化过夜也无不良影响。
可选步骤，一般不需要: 如果RNA残留较多，需要去除RNA，可在完成操作步骤5后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟。
6.加入200μl结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，70℃放置10分钟。
7.冷却后加入100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
8. 将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。
9.加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。
10. 加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。
11. 加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。
12.将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
13. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热效果更好）， 室温放置3-5分钟，12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。
14. DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20℃。
v 问题与解决方法
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问题 |
评论与建议 |
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DNA产量低 |
*某些种类酵母裂解困难-建议：仔细阅读步骤2，确认处理的酵母种类可以用lyticase裂解，还可以考虑选用其它裂解方法如Zymolase、玻璃珠涡旋、煮沸、反复冻融等，lyticase最好按照使用量分装冻存，保证有效性，使用早对数生长期酵母。 *蛋白酶K失效了-建议：按照每次使用量分装冻存，避免反复冻融，延长处理时间。 *裂解不完全或者和异丙醇没有充分混匀-建议：加入结合液后，和加入蛋白酶K后立即吹打或者涡旋混匀；加入异丙醇后立即吹打或者涡旋混匀才加入吸附柱，如果太粘稠必须涡旋振荡15秒充分混匀。 |
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DNA降解了 |
*组织中核酸酶活性导致降解-建议：样品处理前妥善保存在－20℃，处理量不要过量。 |
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未提取到DNA |
*漂洗液WB中忘记加无水乙醇-建议：第一次实验时，在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇。 |
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洗脱下来的 |
*离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇-建议：确保做了步骤12，否则残留乙醇会影响洗脱效率。 *使用了水或者其它非最佳液体代替洗脱缓冲液-建议：仔细阅读注意事项7和步骤13和只使用洗脱缓冲液EB洗脱。 |
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A260吸光值 |
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来，干扰了吸光值-建议：将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟，小心取上清使用。 |
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DNA下游酶切 |
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来，抑制了酶切反应-建议：将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟，小心取上清使用。 *离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇抑制了酶切反应-建议：确保做了步骤12，然后空气中晾几分钟，让残留乙醇挥发。 |