固定包埋组织DNA快速提取试剂盒（离心柱型）

目录号：40312

v  适用范围：

适用于快速提取各种福尔马林固定和石蜡包埋组织DNA

v试剂盒组成、储存、稳定性：

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果

储存事项:

1.   结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

2.   为避免降低活性、方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后，10mg/20mg加入0.5ml/1ml灭菌水溶解，因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分装冻存，－20℃保存。

3.   避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

v 产品介绍：

福尔马林固定或者石蜡包埋组织通过独特裂解液热处理和蛋白酶K共同作用迅速裂解细胞释放出基因组DNA，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤， 抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除， 最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

v  {C}产品特点：

1.          离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

2.          不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

3.          快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。

多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值达1.7～1.9，长度可达30kb -50kb，可直接用于PCR，Southern-blot和各种酶切反应。

v  注意事项：

1.          所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2.          需要自备乙醇（需要准备100%/80%/60%/40%不同浓度）或者二甲苯。

3.          实验前将需要的水浴先预热到37℃备用。

4.          结合液CB 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

5.          洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保批pH大于7.5， pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在－20℃。DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

v  操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

提示：第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

1.          将组织切片放入离心管子，浸泡在二甲苯中脱蜡约30分钟（具体时间根据切片厚度调整）。

2.          将切片依次放入100%乙醇/80%乙醇/60%乙醇/40%乙醇/去离子水，每个液体中浸泡10秒钟重新水化切片。

刚放入100%乙醇时，应该见到切片变白。

3.          显微镜观察下，用刀片切下拟提取DNA的目标组织，放入预先称重的1.5ml离心管。再次称重，计算出切片组织重量。

4.          在25-50mg组织中加入200μl裂解液FTL,再加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立即混匀混匀后置37℃水浴过夜。

5.          再加入10μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，混匀后55℃水浴1-2小时。

此步骤后，不应该见到粗大的组织颗粒了。

6.          加入200μl 结合液CB，立刻涡旋振荡20秒充分混匀后置70℃水浴10分钟。

7.          冷却后加入100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡30秒充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

8.          用1毫升的枪头吸取混合物，将混合物加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液。

如果有不溶组织物可能堵住枪头，可将枪头在吸水纸上轻蹭去除不溶物；如果吸上来的混合物少则可以将枪头和不溶物一起弃去，该做法是为了去除不溶物，以免堵塞离心柱。。

9.          加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。

10.      加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

11.     加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

12.      将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

13.     取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB （洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热效果更好）， 室温放置3-5分钟，12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。

洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

14.     DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20℃。

v 附录：另外一种脱蜡方式

1.        将目标组织切片放入离心管，加入1ml 100%二甲苯，涡旋振荡10秒。瞬间离心把组织全部浸入到二甲苯。

2.        50℃水浴3分钟熔解石蜡，20-25℃最高速离心2分钟，收集组织到管底。

3.        小心用移液器吸弃上清二甲苯，注意不要吸到沉淀。

4.        加入1ml无水乙醇，涡旋振荡，最高速离心2分钟，小心吸弃上清乙醇。

5.        加入1ml无水乙醇，重复步骤6一遍，尽可能吸弃所有乙醇。

6.        室温或者37℃ 晾干乙醇10分钟或直到所有乙醇挥发干。

v  问题与解决方法：