凋亡DNA Ladder快速提取试剂盒

目录号：40116

目录编号	包装单位
40116-20	20次
40116-50	50次

适用范围：

试剂盒组成	保存	20次	50次
裂解/结合液CB	室温	6ml	15ml
漂洗液WB	室温	6ml	15ml
		第一次使用前按说明加指定量乙醇
洗脱缓冲液EB	室温	15ml	15ml
吸附柱AC	室温	20个	50个
收集管（2ml）	室温	20个	50个

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

适用于快速提取凋亡DNA Ladder

试剂盒组成、储存、稳定性：

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

储存事项:

1.   裂解/结合液CB低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

2.   避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品介绍：

细胞发生凋亡时，染色质DNA在核小体之间发生断裂，最终形成200bp整数倍的DNA片段，这些DNA片段被提取后，经电泳及溴化乙锭染色后形成梯子状外观，谓之DNA Ladder。血液和组织培养细胞在裂解/结合液中裂解后，释放出来的DNA片段在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将DNA Ladder片段从硅基质膜上洗脱。

产品特点：

1. 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

2.  本公司独有的裂解/结合液配方有效裂解细胞，使用本试剂盒不需要加入昂贵的蛋白酶K处理，大大降低了使用成本和加快了处理速度。

3.节省时间，简捷，单个样品操作一般可在10分钟内完成。

注意事项

1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2.  开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。

3.   裂解/结合液CB含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

4.   一般2×10⁶培养细胞DNA产量为10-20μg， 200μl人全血典型产量为3-6μg。

5. 一般电泳检测时典型上样量为2-3μg纯化的DNA，如果凋亡率低，有可能只见到基因组DNA，而见不到DNA ladder，可以试试加大上样量。

操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

提示： 第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

1.   取2×10⁶个细胞（悬浮细胞或者组织培养细胞重悬在200μl PBS中）或者200μl全血（大约含有2×10⁶个细胞）加入200μl 裂解/结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀。

可选做步骤: 如果RNA残留较多，影响凋亡DNA ladder的观察，可以在加入200μl裂解/结合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟。

细胞或者全血处理起始量最大可达300μl，如果起始量介于200μl-300μl之间，则需要按比例相应提高后面使用试剂量。

2.  室温（15℃-20℃）放置10分钟。

3.   加入100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

上述步骤中适当力度充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量。如果样品粘稠不易混匀，则可以涡旋振荡15秒。

4.  将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。

5.   加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

6.   加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

7.   将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇影响洗脱效率和下游反应。

8.   取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热）， 室温放置3-5分钟，12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。

洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

9.  DNA可以直接使用或者存放在－20℃，但是不要超过14天。

10.  取大约2-3μg纯化的DNA电泳检测（注意200μl人全血典型产量只有3­-6μg）。

问题与解决方法:

问题	评论与建议
没有DNALadder 条带，只见到 未凋亡细胞的 基因组条带	*细胞未凋亡或者凋亡细胞率太低-建议：提高凋亡剂的浓度或者延长凋亡诱导时间
未见到DNALadder 条带，也未见到 非凋亡细胞的 基因组条带	*分离的DNA产量太低-建议：加大起始细胞处理量，按比例扩大试剂使用量。确保做了步骤7，以免乙醇残留降低洗脱效率。 *样品本身含有DNA量少（如人全血），电泳上样量太低，-建议：可以加大洗脱下来纯化DNA的电泳上样量。
DNA弥散， 未见Ladder	*凋亡晚期，非特异的剪切DNA所致-建议：在凋亡较早期时提取DNA Ladder（或者做多个不同时期动态连续检测）。
背景高， DNA Ladder弱 或者不明显	*RNA污染太多，影响了观测-建议：将洗脱的纯化DNA加入DNase free的RNase 至终浓度2μg/ml，室温（15℃-20℃）放置20分钟降解污染的RNA。此外, 正常细胞含有更多的RNA,凋亡细胞比例过低时易残留更多RNA,因此RNA残留较多,往往提示凋亡细胞比例过低,可以根据实际情况调整诱导条件.