λ噬菌体基因组DNA快速提取试剂盒（离心柱型）

目录号：40212

适用范围：

适用于快速λ噬菌体DNA

试剂盒组成、储存、稳定性：

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

储存事项:

1.   在RNase A管和DNase I管分别加入1毫升的裂解缓冲液吹打，颠倒混匀，充分溶解RNase A和DNase I后，按照每次使用量分装－20℃冻存，有效期6个月。

2.   结合液LB低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

3.   避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品介绍：

λ噬菌体载体广泛用于文库筛选，目的克隆培养获得大量的噬菌体颗粒需要提取λ噬菌体DNA来开展测序等后续工作。λ噬菌体裂解培养物离心后的上清，首先用RNase A /DNase I混合酶消化去除残留的宿主菌DNA/RNA，沉淀收集噬菌体，噬菌体被SDS裂解，残留碎片通过沉淀离心去除掉。裂解物上清中的λ噬菌体DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将λ噬菌体DNA从硅基质膜上洗脱。

产品特点：

1.          不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

2.          节省时间，简捷，可用于液体培养裂解物和固体培养板的提取，单个样品操作一般可在1.5小时内完成。

3.          产量高，典型的产量10ml λ噬菌体裂解培养物上清可以提取约10µg λ噬菌体DNA。

4.          多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9。可以直接用来酶切和测序。

v  注意事项：

1.          使用转速可以达到13,000rpm的冷冻离心机。

2.          开始实验前将需要的水浴先预热到37℃备用。

3.          需要自备氯仿，20％SDS。

结合液LB含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣

4.          服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

v  操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

以10 ml噬菌体感染细菌培养上清提取举例：

提示：

ð第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

ð  将噬菌体沉淀液放在冰上预冷。

1.          将0.5%氯仿处理后的λ噬菌体感染的液体培养物10,000g（约12,000rpm） 4℃离心10分钟去除细胞碎片和残渣。

转速不能过高，时间不能过长，否则噬菌体可能和碎片一起沉淀，降低产量。

2.          取10ml上清，加入20μl RNase和20μl DNase充分混匀37℃温育30分钟。

每个噬菌体培养上清因生长和裂解情况不同而残留RNA/DNA量不等。RNase/DNase消化过头，可能减少产量；消化不完全，可能未消化的DNA/RNA和细胞碎片粘去部分噬菌体减低产量并/或者导致最后污染宿主菌DNA，因此应该根据实际情况适当调节用量和消化时间。

3.          加入2 ml 冰预冷的噬菌体沉淀液，轻柔充分混匀后置冰上冷却（培养板裂解物必须在冰上放置30分钟）。

4.          10,000g（12,000rpm）4℃离心10分钟，弃上清，干燥1分钟。沉淀下来的噬菌体外观为透亮或者稍白的沉淀。

5.          加入500μl裂解缓冲液，吹打重悬噬菌体，加入100μl 20％SDS，立即轻柔颠倒混匀4-6次后，70℃温育10分钟，然后置冰上冷却。

6.          加入100μl杂质沉淀液，立即轻柔颠倒混匀4-6次，最高速13,000g 4℃离心10分钟。

7.          仔细将上清转入新的离心管，加入350μl结合液LB，轻柔涡旋混匀。

8.          将上述混合物加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）12,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。

吸附柱一次最多只可以容纳大约700μl混合物，因此需要分次把混合物上到吸附柱内，重复步骤8。

9.          加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃废液。

10.       可选步骤：重复步骤9一遍。

11.       将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

12.       取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 50℃水浴中预热）， 室温放置1分钟，12,000rpm 离心1分钟。如果想得到较多量的DNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，12,000rpm离心1分钟。

洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于40μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

13.       DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。
问题与解决方法: