HiPure Yeast Plasmid Mini Kit
酵母高纯度质粒小量快速提试剂盒
目录号：31016
产品内容：
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产品组成 |
保存 |
31016-50 |
31016-100 |
31016-200 |
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溶液YP1 |
室温 |
15 ml |
25 ml |
50 ml |
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溶液YP2 |
室温 |
15 ml |
25 ml |
50 ml |
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溶液YP3 |
室温 |
20 ml |
35 ml |
70 ml |
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去蛋白液 PD |
室温 |
25 ml |
50 ml |
100 ml |
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漂洗液 WB |
室温 |
13 ml |
25 ml |
50 ml |
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洗脱缓冲液 EB |
室温 |
10 ml |
15 ml |
20 ml |
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RNase A (10 mg/ml) |
-20℃ |
150 ul |
250 ul |
500 ul |
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Lyticase |
-20℃ |
2500U |
5ku |
10ku |
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吸附柱和收集管 |
室温 |
50 套 |
100 套 |
200 套 |
保存条件：
在室温(15 ~ 25℃)干燥条件下，可保存 12 个月。加入 RNase A 后的溶液 P1 应置于 2 ~ 8℃保存，可稳定保存 6 个月,如果 P1 中 RNase A 失活，重新补加即可。
产品简介：
本试剂盒用于高纯度酵母质粒 DNA 的小量制备。菌体经碱裂解、高盐、低 pH 处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心吸附柱吸附。通过清洗液的洗涤可去除杂质，在低盐、高 pH 条件下洗脱，最后得到纯度较高的质粒 DNA。所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、RT-qPCR、测序及转染等分子生物学实验。
注意事项：
1. 通常酵母的拷贝数都很低，高拷贝最大得率一般为每 5 ml 培养物提取 1μg 左右的质粒。用于下游试验时通常建议使用量为： 1-5μl 用做 PCR 模板;5-10μl 用于转化大肠杆菌,选择高效率的感受态细胞。
2. 用户需要自备 Sorbitol buffer( 1M 山梨醇， 0.1M Na2EDTA，14 mMβ-巯基乙醇)。配制方法：在 600 ml 去离子水里面溶解 182.2 克山梨醇，加入 200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要调节 PH 值，定容到 1L，4℃保存。临用前加 0.1%β-巯基乙醇(商品化的 β-巯基乙醇摩尔浓度一般为 14M)。
3. 使用前请先检查平衡液、溶液 YP2 和溶液 YP3 是否出现浑浊，如有混浊现象，可在 37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。
4. 溶液YP1，YP2 和YP3 的用量比例，若细菌量增大，需按比例放大这些溶液的使用量；重要提示：
一、第一次使用前请先漂洗液 WB 中加入无水乙醇（详见瓶身标签），混匀，并做好标记。
二、首次使用时请先将 RNase A 全部加到溶液 YP1 中，混匀，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存。
三、吸取使用量的Sorbitol buffer 加入 0.1%β-巯基乙醇，回复到室温备用。
操作步骤：
1.取 1.5-5 毫升酵母培养物(不超过 5x 107 cells)，9,000rpm 离心 30 秒，尽可能的吸弃上清，收集菌体。
（注意： 如果用 50ml 离心管收集菌体，可以离心弃上清后，在同一管内加入更多的菌液，重复步骤 1，直到收集到足够多的菌体）
2. 加入 600μl Sorbitol buffer，轻柔吹打充分重悬细胞；可按照 20-50U/1x107 cells 的比例加入 Lyticase(一般 5 ml 培养物可能需要加到 200U)，充分颠倒混匀，37℃温育至少 30分钟消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。
（注意：如果破壁效果不好导致质粒产量低，可以加大 lyicase 用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间来提高效果，不适合 Lyticase 消化的酵母可选用 Zymolase 或者其它方法如玻璃珠涡旋，反复冻融等。）
3. 13,000rpm 离心 1 min，尽可能吸弃上清，加入 250 ul 溶液YP1，重悬菌体沉淀，涡旋震荡至彻底悬浮。
（注意：如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低）
4. 加入 250 ul 溶液YP2，温和地上下翻转 6-8 次，使菌体充分裂解，室温放置 4 min。
（注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组 DNA 片段的污染，所用时间不要超过 5 min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加溶液 P2 的用量，在后续的操作中溶液 YP3 的用量也要相应增加）
5.加入 350 ul 溶液 YP3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀，
然后室温 13,000 rpm 离心 10 min。
（注意：加入溶液 YP3 后应立即混合，避免产生 SDS 的局部沉淀）
6. 将上清液转移到吸附柱中，室温 12,000 rpm 离心 1 min，质粒被吸附在膜上，弃滤液。
7. 可选步骤：向吸附柱中加入 500 ul 去蛋白液 PE，室温 12,000 rpm 离心 1 min，弃滤液。
（注意：去蛋白液 PE 为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防酒精挥发）
（注意：如果宿主菌是 endA-，如 DH5α或 TOP10，此步骤可省略。如果宿主菌是 endA+，如 TG1、BL21、 HB101、JM101 等，此步骤不可省略，因这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒。如果提取低拷贝质粒也推荐采用此步骤）
8.加入 600 ul 漂洗液 WB，室温 12,000 rpm 离心 30 sec，弃滤液。
（注意：漂洗液 WB 为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防酒精挥发）
9. 重复步骤 8 一次。
10. 室温 12,000 rpm 离心 2 min，甩干残留液体。
（注意：此步不能省略，否则残留乙醇会影响质粒的后续使用）
11. 将吸附柱置于一个新的 1.5 ml 离心管（自备）中，加入 50 ~ 100 ul 的洗脱缓冲液 EB，室温放置 2 min，12,000 rpm 离心 1 min，离心管底溶液即质粒 DNA。
（注意：事先在 65~70℃水浴中预热洗脱缓冲液 EB，可增加洗脱效率；如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，再次离心 1 min 收集；如需使用去离子水洗脱，可用 NaOH 调整其 pH 值在 7.0 - 8.5 之间。）